百药煎传统炮制过程中微生物的分离、鉴定及降解鞣质最佳菌种组合的筛选

发布时间：2020-04-15 16:50

【摘要】：百药煎是由五倍子、茶叶和酒糟等原料经自然发酵制备而成的传统中药饮片,具有润肺化痰、解热生津等功效,主治肺虚久咳、便血痔血、皮肤湿烂等症。五倍子为百药煎的主要原料,含有大量鞣质类成分。据报道,百药煎中五倍子鞣质经生物转化生成药效物质没食子酸。没食子酸具有抗菌、抗病毒、降糖降脂等药理活性。百药煎传统炮制是利用自然界存在多种微生物的混合固体发酵完成,存在发酵菌种不稳定、混杂有无效菌株,可能造成百药煎发酵基质中没食子酸浓度波动性较大,影响百药煎的质量稳定。因此,分离鉴定百药煎传统炮制过程中关键微生物菌群及筛选可用于百药煎现代发酵的菌种,有助于实现百药煎的现代稳定菌种组合的混合固体发酵工艺。本文采用经典的微生物分离与分类方法,从百药煎传统炮制过程样品中分离获得其中微生物菌群,并结合菌种形态特征(菌落形态、显微形态)、部分生理生化特性和16SrRNA/18SrRNA分子生物学特性,对其进行初步的分类鉴定。进一步考察了菌种的抑菌活性、产蛋白酶和淀粉酶能力及其鞣质转化特性;以具有降解鞣质能力的微生物为出发菌种,开展单菌发酵和混菌液体发酵,筛选出单菌鞣质降解能力较强菌株及具有协同增强鞣质降解生成没食子酸能力的最佳混菌组合。固态发酵进一步验证筛选得到的最佳混菌组合,并初步优化其固态发酵工艺。主要研究结果如下:通过剔除类同菌种后,从百药煎传统炮制过程的样品中共分离纯化获得17种菌,并初步鉴定为:7种细菌(地衣形芽孢杆、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌、巨大芽孢杆菌菌株、同温层芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌)、7种酵母菌(伯顿丝孢毕赤酵母、克鲁维酵母菌、克鲁维酵母菌、弗比恩酵母菌、奥默柯达菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌)、3种丝状真菌(青霉菌属真菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌属真菌)。百药煎样品中暂未分离得到致病菌。通过抑菌活性分析,发现菌种HMB3、HMB4、HMB7和HMY3代谢产物具有抑制金黄色葡萄球菌的活性,其中菌种HMB3和HMB7的代谢产物还具有抑制大肠杆菌的活性。所有细菌均具有产胞外蛋白酶能力,其余菌株均无此能力;所有菌株均无产胞外淀粉酶能力。通过平板初筛得到13种具鞣质降解特性的菌种,包括5种细菌(HMB1、HMB2、HMB3、HMB5、HMB6);5 种酵母菌(HMY1、HMY2、HMY5、HMY6、HMY7);3 种丝状真菌(HMF1、HMF2、HMF3)。对具有鞣质降解能力的菌种进行单菌发酵和混菌液体摇瓶发酵培养,以HPLC方法检测发酵液中没食子酸的含量,筛选获得具协同降解鞣质生成没食子酸能力的最佳混菌组合为HMB2、HMB5、HMY1、HMY2的四菌组合。最佳混菌组合固态发酵工艺优化后:在底物浓度为50%、接种量为1.2ml,细菌和酵母菌的接种比例为1:2,30℃条件下培养66h,百药煎中没食子酸含量约为0.59g/g样品,而百药煎传统炮制品中没食子酸为0.52 g/g百药煎,增加了约11%,且最佳混菌固态发酵后样品对金黄色葡萄球菌的抑制活性均优于百药煎炮制品。本研究获得最佳混菌组合为实现百药煎的现代工业化生产奠定了菌种基础,也降低了百药煎饮片发酵过程中真菌毒素污染的可能性。
【图文】：

２．３．２．１细菌的分离逡逑在ＬＢ培养基中添加可抑制真菌生长的制霉菌素用以分离样品中的细菌，分逡逑离得到的部分细菌菌落形态见图２－１。逡逑：逡逑图２－１百药煎样品中细菌分离结果（１？４分别为样品Ｃｌ？Ｃ４的稀释液细菌分离结果，５和６逡逑分别为样品Ｃ７和Ｃ８稀释液的细菌分离结果）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｇａｌｌ邋ｌｅａｖｅｎ邋（１？４：邋ｔｈｅ逡逑ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｄｉｌｕｔｅｄ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｅ邋Ｃ１－Ｃ４，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋５，邋６：逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋Ｃ７邋ａｎｄ邋Ｃ８邋ｄｉｌｕｅｎｔｓ，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．逡逑由图２－１可见，上述培养基中总共出现了邋７yL不同的细菌，第１种菌落圆形，逡逑灰白色，，轻微凸起、边缘无规则、湿润；第２种淡黄白色、扁平、表面湿润、周逡逑围有透明圈；第３种菌落黄白色、表面无规则干燥褶皱，、生长早期有小水珠；逡逑第４种菌落暗黄色、湿润

Ｃｌ邋Ｃ２邋Ｃ３邋Ｃ４邋Ｃ５邋Ｃ６邋Ｃ７邋Ｃ８逡逑样品编号逡逑图２－２百药煎炮制过程中细菌的菌数变化规律逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｒｕｌｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｕｎｔｓ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｇａｌｌ邋ｌｅａｖｅｎ逡逑由图２－２可见，在百药煎炮制过程种菌株ＨＭＢｌ、ＨＭＢ３和ＨＭＢ７菌数变化逡逑规律相同、在样品Ｃ１￣Ｃ５中菌数均无明显变化，在样品Ｃ６中菌数开始增加，并逡逑在样品Ｃ７和Ｃ８中菌数急剧增多。逡逑２．３．３真菌的分离与纯化逡逑在ＰＤＡ培养基中添加可抑制细菌生长的硫酸链霉素用以分离样品中的真菌，逡逑分离得到的部分真菌菌落形态见图２－３。逡逑曑匪逡逑图２－３百药煎样品的上真菌分离计数结果图（ａ？ｄ分别为样品Ｃ１？Ｃ４稀释液中真菌分离结逡逑果；ｅ为样品Ｃ８稀释液的真菌分离结果）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｉ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ逦NB“／／邋／ｅｍｍ邋（ａ￣ｄ：邋ｔｈｅ邋ｆｕｎｇｉ逡逑ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕＵｓ邋ｏｆ邋１０邋ｔｉｍｅｓ邋ｄｉｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｅ邋Ｃ１邋？Ｃ４，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋ｅ：邋ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｉ邋ｉｓｏｌａｔｂ＾＾逡逑ｏｆ邋１０邋ｔｉｍｅｓ邋ｄｉｌｕｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｅ邋Ｃ８）逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：中国医药工业研究总院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R283

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本文编号：2628766