荆芥挥发油与胡薄荷酮对LPS中毒模型小鼠的抗炎效应及NLRP3通路机制研究

发布时间：2020-04-18 21:32

【摘要】：目的:观察荆芥挥发油与胡薄荷酮对LPS中毒模型小鼠的保护作用,并从NLRP3炎症小体角度,探讨荆芥挥发油及胡薄荷酮抗炎效应的NLRP3炎症小体通路分子机制,进一步完善荆芥挥发油的抗炎作用研究,揭示其主要物质基础。方法:(1)荆芥挥发油提取与化学成分分析:依照2015版中国药典第四部通则2204挥发油提取中甲法提取荆芥挥发油,采用GC-MS法进行挥发油成分分析。(2)LPS造模最佳剂量和最佳指标检测时间点筛选:采用小鼠腹腔注射不同剂量LPS进行造模,通过观察小鼠造模后不同时间点小鼠的呼吸频率、脾脏指数、胸腺指数、肺指数,及小鼠血清IL-1β含量和肺组织内NLRP3蛋白表达的变化,确定最佳造模剂量及指标检测时间点。(3)药物对LPS中毒模型小鼠的保护作用:(1)观察药物对模型小鼠白细胞(WBC)计数和血小板(PLT)计数、脏器指数及肺组织病理形态学的影响。(2)ELISA法及液相蛋白芯片技术测定血清中炎症因子IL-18、IL-1β、IL-5、TNF-α、IFN-γ、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1β)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及IL-10的水平。(3)Griess法测定肺组织中NO含量。(4)药物对LPS中毒模型小鼠抗炎保护效应的NLRP3炎症小体信号通路机制研究:(1)实时荧光定量PCR法测定肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、p65、iNOS、IL-18、STAT1、IFN-α、IFN-βmRNA的表达。(2)免疫组化法检测肺组织中P2X7R、组织蛋白酶B(Cathepsin-B)的表达。(3)Western blot法测定肺组织中NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-12、COP1、POP1、Caspase-1(p20)、pro-IL-1β蛋白表达水平。结果:(1)GC-MS检测结果显示,荆芥挥发油中薄荷酮、胡薄荷酮的相对含量分别为46.67%、33.92%,二者含量占总挥发油的80.59%。(2)LPS以15mg/kg剂量腹腔注射,造模后12 h可见小鼠呼吸频率加快、血清IL-1β含量及全血白细胞计数(WBC)增加,小鼠肺指数、脾脏指数明显升高,且肺组织内NLRP3蛋白表达量明显较其他时间点升高,以此剂量与时间作为造模条件。(3)荆芥挥发油与胡薄荷酮对模型小鼠全血WBC的显著增加,PLT的显著降低,脾脏指数、肺指数的显著升高及胸腺指数的显著降低,有一定作用趋势,但无统计学意义。地塞米松能显著降低模型小鼠的脾脏指数与胸腺指数。(4)荆芥挥发油能显著降低模型小鼠血清IL-1β、IL-5、TNF-α、MCP-1、MIP-1β、M-CSF、IFN-γ水平,0.452g/kg荆芥挥发油亦能明显降低小鼠血清IL-18、GM-CSF水平。胡薄荷酮能明显降低模型小鼠血清IL-18、IL-1β、IL-5、MIP-1β、M-CSF水平,0.19g/kg胡薄荷酮亦可明显降低小鼠血清TNF-α、MCP-1、GM-CSF水平。0.226g/kg荆芥挥发油与0.19g/kg胡薄荷酮明显减少模型小鼠肺组织内嗜中性粒细胞数目,减轻肺脏急性炎性细胞浸润。0.452g/kg荆芥挥发油与0.19g/kg胡薄荷酮能显著降低模型小鼠肺组织内NO水平。(5)荆芥挥发油和胡薄荷酮能明显下调模型小鼠肺组织NLRP3、iNOS、p65、IL-1β、STAT1mRNA的表达,荆芥挥发油亦能抑制IFN-β、IFN-αmRNA的表达。荆芥挥发油和胡薄荷酮均能下调模型小鼠肺组织CathepsinB、p20蛋白表达,二者均能提高COP1蛋白表达水平,荆芥挥发油能抑制P2X7R、NLRP3蛋白表达,胡薄荷酮能抑制pro-IL-1β蛋白表达。结论:荆芥挥发油与胡薄荷酮对LPS中毒模型小鼠表现出较好的抗炎保护作用,能抑制炎症因子释放,减轻炎性细胞浸润。其抗炎作用机制与干预、调控NLRP3炎症小体的激活有关,胡薄荷酮为荆芥挥发油抗炎有效活性成分之一。
【图文】：

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图 1 LPS 致内毒素中毒小鼠造模后不同时间点肺组织 NLRP3 蛋白表达量变化（n=4）2.3 荆芥挥发油与胡薄荷酮对内毒素中毒模型小鼠的保护作用2.3.1 小鼠内毒素中毒模型的建立取健康 C57BL/6J 雄性小鼠，按体重分层随机分为空白组、模型组、地塞米松（5 mg/kg）组，荆芥挥发油 0.226g/kg 、0.452g/kg 组，胡薄荷酮 0.095g/kg 、0.19g/kg 组。除地塞米松组外，其余给药组小鼠按 0.2mL/10g 体积灌胃给药，空白组与模型组给予等体积 0.35%吐温-80 溶液，连续给药 4 d，动物禁食不禁水12 h，第 5 d(地塞米松组 ip 给药）给药后 30min ，小鼠腹腔注射 LPS(15mg/kg，，0.1mL/10g)造模，造模后 12 h 小鼠取血，3500rpm/min，离心 10min，分离血清，剖取小鼠肺组织，进行相关指标检测。2.3.2 对模型小鼠白细胞计数及血小板计数的影响

取小鼠全血 20μL 至装有 2mL 稀释液的 EP 管中，混匀，采用全自动血细胞分析仪测定白细胞计数。结果见表 8 和图 2。由表8和图2可知，与空白组比较，模型组小鼠全血WBC显著增加（P<0.05），血小板 PLT 显著降低（P<0.05）。各药物组对 WBC、PLT 计数影响不明显。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】

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本文编号：2632556