山楂叶总黄酮对脊髓损伤大鼠受损神经保护及修复作用的研究

发布时间：2020-04-18 22:57

【摘要】：背景与目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种神经系统创伤性疾病,主要表现为神经功能障碍、缺失,重者会导致瘫痪残疾或者死亡。主要的致病因素是患者脊柱受到外界暴力的打击,而造成脊髓的损伤。随着对脊髓损伤的治疗的研究不断加深,越来越多的方法能够缓解脊髓损伤带来的伤害,在一定程度上减轻脊髓损伤患者的临床症状,但是目前治疗的方法都存在有一定的缺陷,如有不良反应产生、疗效不明确、价格高昂、患者依从性差等,能够完全治愈脊髓损伤的理想治疗方法还未找到。山楂叶总黄酮(Total flavonoids from hawthorn leaves,TFHL)是一种具有生物活性的植物化学物,它的主要成分为黄酮类化合物,有研究表明该物质具有降压、降脂、抗炎、抗氧化等作用,在对于治疗脊髓损伤的方向还未有研究。本课题组就山楂叶总黄酮对脊髓损伤的神经保护功能展开研究,在改良的Allen法建造的大鼠脊髓损伤模型上,检测山楂叶总黄酮能否对脊髓损伤后大鼠的神经功能的恢复有促进作用,对损伤后的炎性因子分泌是否具有抑制作用,对损伤后的神经营养因子是否有促进作用,探讨山楂叶总黄酮对脊髓损伤后神经保护作用及其作用机制,并为后续实验打下基础。方法:1、利用改良的ALLEN打击法构建大鼠脊髓损伤的动物模型,根据实验要求分为五个组:假手术组(SHAM组)、损伤组(SCI组)、山楂叶总黄酮治疗组:低剂量组12.5mg/kg、中剂量组25mg/kg、高剂量组50mg/kg。2、使用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分方法在SCI后1d、3d、5d、7d几个时间点内对大鼠进行脊髓损伤段以下的神经肢体运动的观察,分析大鼠运动行为学的变化。3、采用HE染色方法对脊髓组织进行染色,观察脊髓损伤后脊髓组织的病理变化情况与山楂叶总黄酮对损伤脊髓的组织修复情况。采用扫描电镜观察脊髓神经细胞中细胞器的变化情况,观察山楂叶总黄酮对细胞器变化的影响。4、采用尼氏染色法对大鼠的脊髓组织进行染色,观察神经元细胞的病理变化情况,计算脊髓组织中神经元与尼氏小体的数量,分析山楂叶总黄酮对神经细胞的修复作用。5、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,实时荧光定量PCR检测大鼠脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α相关基因的表达,分析炎性因子在脊髓组织中的变化情况。6、采用实时荧光定量PCR检测各组脊髓组织中胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)相关基因表达,Western Blot检测各组脊髓组织GDNF、NGF、CNTF、BDNF蛋白的表达。分析山楂叶总黄酮对脊髓组织中神经营养因子变化的影响。结果:1、BBB评分检测大鼠运动神经功能情况:在脊髓损伤后的各个检测时间点内,其中假手术组大鼠的运动功能正常,分值为稳定最高值;损伤组分值明显降低(P0.01),随时间的增加而升高,随药物剂量浓度的改变有不同程度的升高,当药物浓度为25mg/kg时,评分数值达到最高峰值(P0.05)。2、术后72小时,HE染色结果显示,假手术组细胞形态正常,细胞核完整,大小正常,排列整齐,无出血点;损伤组出现炎症浸润,有出血点,出现大量空洞,细胞核形态改变;治疗组较损伤组细胞形态都有所好转,空洞数量减少,出血点减少,在山楂叶总黄酮浓度为25mg/kg时,效果最明显,其空洞率较损伤组明显减小(P0.05)。3、扫描电镜结果显示,假手术组中髓鞘外形有规则,排列整齐紧凑,结构完整,线粒体饱满;损伤组髓鞘外形不规则,排列混乱,板层结构排列松散,线粒体肿胀;山楂叶总黄酮干预组病理现象均有好转,髓鞘外形较为规则有序,板层结构较为紧凑,线粒体肿胀减轻。在山楂叶总黄酮浓度为25mg/kg时,程度较损伤组有明显的改善,病理变化最少。4、ELISA检测炎性因子的IL-1β、IL-6和TNF-α含量变化的结果显示,SCI组较SHAM组明显增高(P0.01)随着治疗组给药浓度的逐步增高,各组中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均下降,当药物浓度达到25mg/kg时,各组中的因子降到最低值(P0.05)。5、RT-PCR法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的表达结果显示,损伤组较假手术组的相对表达量明显增加(P0.05);与损伤组相比,治疗组中相对表达量有所降低,当山楂叶总黄酮浓度为25mg/kg时,差异最显著(P0.05)。6、尼氏染色结果显示,假手术组脊髓形态结构完整,神经元细胞形态大小正常,可见斑块样尼氏体;损伤组神经元形态固缩坏死,尼氏小体数量减少;给药组随山楂叶总黄酮浓度的升高,神经细胞恢复状态越好,当剂量浓度为25mg/kg时,病理症状最轻,且尼氏小体与神经元数量都有所增加(P0.05)。7、RT-PCR检测GDNF、NGF、CNTF、BDNF mRNA表达的结果为,与假手术组相比,损伤组大鼠脊髓中的GDNF、NGF、CNTF、BDNF的相关基因相对表达量有所增加;与损伤组相比,治疗组中的GDNF、NGF、CNTF、BDNF相关基因相对表达量增加,当山楂叶总黄酮浓度为25mg/kg时,差异具有统计学意义(P0.05)。8、Western blot检测GDNF、NGF、CNTF、BDNF的蛋白表达结果为,损伤组中的各个营养因子较假手术组都有一定增加,山楂叶总黄酮组中的GDNF、NGF、CNTF、BDNF蛋白的表达量都增高,当山楂叶总黄酮剂量浓度为25mg/kg时,神经营养因子蛋白表达量最高(P0.05)。结论:1、山楂叶总黄酮能够促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。2、山楂叶总黄酮能够减轻大鼠脊髓损伤后的脊髓组织病理变化情况,如出血、水肿、空洞等,同时减轻神经细胞的病理变化,说明山楂叶总黄酮能够促进脊髓神经细胞的修复,对神经细胞具有保护作用。3、山楂叶总黄酮能够降低脊髓损伤中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,说明山楂叶总黄酮能够调控脊髓组织中炎性因子的释放,对炎症反应具有抑制作用,进而促进脊髓组织的修复,达到保护脊髓组织的作用。4、山楂叶总黄酮能够促进脊髓组织中的神经营养因子的表达,说明山楂叶总黄酮促进了脊髓神经组织的修复功能,对神经组织起到保护作用。
【图文】：

出血点,组织形态特征,大鼠,苏木精

酮干预对 BBB 评分的影响。A.各组 SD 大鼠 BBB 评分随时间增加而升高小时后各组 SD 大鼠 BBB 评分的比较（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）。of TFHL intervention on BBB score.A. TheBBB scores of SD rats in each groe of time. B. Comparison of BBB scores of SD rats in each group after 72 hocord injury（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001）.组织 HE 染色织固定好切片后进行苏木精伊红染色，于倒置显微镜组织形态特征（图 2）。假手术组（SHAM）无损伤，常，细胞核大小正常，排列整齐，未见出血点；损伤组袭，有出血点产生，出现大量空洞，细胞核形态改变

空洞率,ImageJ软件,倒置显微镜,HE染色

伤组明显减小（P<0.05）。这些现象表明山楂叶总黄酮能够减少炎症反应对脊髓的影响。图2 各组大鼠脊髓组织HE染色，倒置显微镜（×40）下观察，，并用Image J软件计算其空洞率。（*P<0.05，**P<0.01）Figure 2. HE staining of spinal cord tissue of each group was observed under an inverted microscope (×40),and the cavitation rate was calculated by Image J software. （*P<0.05，**P<0.01）3.3扫描电镜观察脊髓组织细胞器形态将组织固定好后制作超薄切片，使用电镜扫描（×20000），观察细胞内的变化情况（图3）。假手术组中髓鞘外形有规则，排列整齐紧凑，结构完整
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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