栀子苷与牛膝总皂苷单用及合用对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞骨架蛋白F-actin的影响

发布时间：2020-04-20 00:36

【摘要】：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种系统性、炎症性自身免疫性疾病,其表现为持续性的慢性滑膜炎,形成大量血管翳,进一步导致关节软骨及骨破坏,甚至引发畸形病变以及严重的并发症。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是RA疾病发生过程中的主要效应细胞,呈肿瘤细胞样生长,并通过分泌高水平炎性细胞因子、趋化因子、基质蛋白降解酶等,调控血管翳的形成,在关节软骨和骨组织的破坏过程中发挥重要作用。RA病变中细胞迁移、细胞侵袭、细胞增殖与凋亡、浸润生长等多种病理改变均与细胞骨架的变化有关。纤维状肌动蛋白(filamentous actin,F-actin),是维持细胞形态和功能的基本细胞骨架,多种刺激可以引起其形态学改变,引发血-关节囊液屏障等生理性屏障通透性的增加,从而损伤其功能。研究表明,F-actin可由滑膜细胞和内皮细胞表达,受Rho A、p38MAPK、核转录因子(nuclear factorκB,NF-κB)等信号通路调控。栀子苷(Geniposide,GE)是从茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis中提取纯化得到的环烯醚萜苷类化合物,具有抗炎、镇痛和抗血管生成以及抗糖尿病等多种药理作用。牛膝总皂苷(Achyranthes bidentata saponins,ABS)为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata BI.)的主要活性成分,牛膝常被用作引药,能够引经报使,引诸药下行到达人体下半身,治疗人体下半身疾病的作用。课题组的前期实验结果证实:GE对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠有抗炎免疫调节作用,能够抑制AA大鼠FLS细胞增殖;下调AA大鼠FLS中白介素(interleukin,IL)-6、IL-17、干扰素-γ(Interferon-gama,IFN-γ)等炎性细胞因子的分泌水平,上调IL-4、转录生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等抗炎细胞因子的分泌水平;下调AA大鼠FLS中p38MAPK的磷酸化水平;ABS能够提高GE在AA大鼠关节腔组织中的靶向分布,对GE具有靶向引导作用。本课题采用AA大鼠模型,以RA的主要效应细胞FLS为研究对象,通过观察GE、ABS单用及合用对FLS功能的影响,探讨FLS表达F-actin水平的改变,研究Rho A调控p38MAPK/NF-κB/F-actin在AA大鼠FLS中的异常变化及作用机制,为中药有效成分的研究与应用提供更多的实验依据。目的:观察GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS细胞增殖的影响;观察GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS分泌细胞因子水平的影响;观察GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65、NF-κB p-p65和F-actin蛋白表达水平的影响,为揭示F-actin参与RA异常炎症反应的病理机制,为中药有效成分对RA的预防与治疗提供新的研究思路。方法:Sprague-Dawley(SD)大鼠左后足足跖皮下注射弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)制备AA大鼠模型,于致炎后d7-d21进行大鼠全身评分、关节炎指数评分及足爪肿胀度测定。致炎后d21腹主动脉取血处死AA大鼠,组织块培养法培养FLS,传至第3代时,体外给药,分组情况如下:control组:空白的DMEM培养液,脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)组:5μg/m L LPS,GE单用组(25,50,100μg/m L),ABS单用组(40μg/m L),ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)及Rho A/ROCK抑制剂Y-27632组(10μM)。CCK-8法筛选出GE与ABS的给药浓度后,检测GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS细胞增殖的影响;ELISA法检测各给药组对AA大鼠FLS细胞上清中IL-1β、IL-17、IL-4和TGF-β1的含量的影响;蛋白质电泳法(Western-blot)法检测各给药组对AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65、NF-κB p-p65及F-actin蛋白的表达量的影响。结果:1 GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS细胞增殖的影响GE体外刺激AA大鼠FLS细胞增殖的合适浓度为(25,50,100μg/m L),GE的亚适浓度(50μg/m L)与五个不同浓度的ABS合用刺激AA大鼠FLS细胞增殖后,选择40μg/m L作为ABS的给药浓度。与正常组相比,LPS组FLS细胞增殖亢进(P0.01)。与LPS组相比,ABS单用组(40μg/m L)对LPS诱导的AA大鼠FLS细胞增殖能力无显著影响,GE单用组(25,50,100μg/m L)、ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)对FLS的细胞增殖均有明显的抑制作用(P0.05,P0.01),Y-27632抑制剂组(10μM)亦可显著抑制FLS的细胞增殖能力(P0.01)。ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)与GE单用组(25,50,100μg/m L)分别比较,ABS与中、高剂量GE合用组(40+50,40+100μg/m L)对FLS细胞增殖均有统计学差异(P0.05)。2 GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS分泌细胞因子的影响与正常组相比,LPS组FLS中IL-1和IL-17的分泌量明显上调,IL-4和TGF-β1的分泌量显著下调(P0.01)。与LPS组比较,ABS单用组(40μg/m L)对AA大鼠FLS分泌的IL-1β、IL-17、IL-4和TGF-β1无显著性差异;GE单用组(25,50,100μg/m L)、ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)对AA大鼠FLS中IL-1、IL-17的分泌水平显著减少,IL-4、TGF-β1的分泌水平显著增加(P0.05,P0.01);Y-27632抑制剂组(10μM)对FLS中IL-1β、IL-17的分泌量亦显著降低,IL-4、TGF-β1的分泌量亦显著增多(P0.01)。与GE单用组(25,50,100μg/m L)分别比较,仅ABS与中、高剂量GE合用组(40+50,40+100μg/m L)对FLS中IL-1β和IL-4的分泌水平有统计学差异(P0.05)。3 GE、ABS单用及合用对AA大鼠FLS中Rho A、p38MAPK、NF-κB及F-actin蛋白表达的影响与正常组相比,LPS组FLS中的Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表达水平显著升高(P0.01)。与LPS组比较,ABS单用组(40μg/m L)对AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表达水平无显著性差异;GE单用组(25,50,100μg/m L)可显著下调AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK和F-actin蛋白的表达(P0.05,P0.01),仅在GE中、高剂量组(50,100μg/m L)对NF-κB p-p65蛋白的表达水平有显著性差异(P0.05,P0.01);ABS与GE合用组(40+25,40+50,40+100μg/m L)对AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin水平均明显降低(P0.05,P0.01);Y-27632抑制剂组(10μM)对AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin蛋白水平亦显著性降低(P0.01)。ABS与GE合用组与GE单用组分别比较,ABS的与中剂量GE合用组(40+50μg/m L)对AA大鼠FLS中p-p38MAPK和F-actin的蛋白表达水平有显著差异(P0.05),ABS与高剂量GE合用组(40+100μg/m L)对FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65和F-actin的蛋白表达水平均有显著差异(P0.05)。结论:1.LPS组FLS细胞增殖亢进;FLS分泌的炎性细胞因子IL-1和IL-17水平明显增加,抑炎细胞因子IL-4和TGF-β水平明显降低;FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65及F-actin的蛋白表达水平均显著增加。2.GE能够显著抑制AA大鼠FLS增殖亢进,可明显降低AA大鼠FLS中炎性细胞因子IL-1β和IL-17的分泌水平,显著升高抑炎细胞因子IL-4和TGF-β1的分泌水平;可明显减少AA大鼠FLS中Rho A、p-p38MAPK、NF-κB p-p65和F-actin的蛋白表达水平,阻断Rho A对p38MAPK/NF-κB/F-actin的调控,达到抑制AA大鼠FLS细胞增殖,恢复促炎细胞因子/抗炎细胞因子之间的动态平衡,抑制炎症发展的作用。3.ABS与低剂量GE合用(40+25μg/m L)时,对GE的抗炎免疫调节作用无显著影响,与中、高剂量GE合用(40+50,40+100μg/m L)时可增强GE的抗炎免疫调节作用。
【图文】：

大鼠,细胞,细胞增殖,给药

4.3 CCK-8法检测各给药组对AA大鼠FLS细胞增殖的影响4.3.1 不同浓度GE对AA大鼠FLS细胞增殖的影响LPS（5 μg/mL）体外刺激 AA 大鼠 FLS，同时设 GE（6.25, 12.5, 25, 50, 100μg/mL）五个浓度组，37 °C，5% CO2培养箱中培养 48 h 后，CCK-8 法检测 450 nm波长处 OD 值。结果如 Fig. 2，GE（25, 50, 100 μg/mL）给药组对 LPS 诱导的 AA大鼠 FLS 细胞增殖有明显的抑制作用（P<0.05, P<0.01），且呈剂量依赖的趋势，故在接下来的试验中选择 25, 50, 100 μg/mL 作为 GE 的适宜浓度。图 1 大鼠FLS的形态学观察（A：原代d3，， B：原代d7，C：原代d11，D：传 3 代细胞）Fig.1 FLS morphology.A: Primary culture of FLS on 3 days;A: Primary culture of FLS on 7days; C: Primary culture of FLS on 11 days; D: The third generation of FLS.

细胞增殖,大鼠

4.3.2 GE（50 μg/mL）与不同浓度 ABS 合用对 AA 大鼠 FLS 细胞增殖的影响用五个不同浓度 ABS（5, 10, 20, 40, 80 μg/mL）与 GE 的亚试浓度（50 μg/mL）合用后体外作用 AA 大鼠 FLS，37 °C，5% CO2培养箱中培养 48 h 后，CCK-8 法测定 450 nm 波长处 OD 值。结果如 Fig. 3 所示，与 LPS 组比较，GE 单用组（50μg/mL）、GE 与五个不同浓度 ABS 合用组（50+5, 50+10, 50+20, 50+40, 50+80μg/mL）对 AA 大鼠 FLS 的细胞增殖均有明显的抑制作用（P<0.01）；与 GE 单用组比较，GE 与 ABS（50+40, 50+80 μg/mL）合用组对 AA 大鼠 FLS 的细胞增殖有下调趋势（P<0.05），故在接下来的实验中选择 40 μg/mL 作为 ABS 的给药浓度。图 2 不同浓度 GE 体外给药对 AA 大鼠 FLS 细胞增殖的影响（ x ±s, n=3）Fig. 2 Effects of GE on the proliferation of FLS onAArats in vitro.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs AAgroup.
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】