原人参三醇抑制SCD1介导的脂质代谢在多发性骨髓瘤中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-20 00:55

【摘要】：第一部分SCD1及脂滴在多发性骨髓瘤中的表达及意义目的:既往研究发现在多种肿瘤中通过抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)表达破坏脂质稳态可以杀伤肿瘤细胞,但目前SCD1在多发性骨髓瘤(MM)发生发展中的作用尚不清楚。本部分研究旨在了解脂肪酸组成调节关键酶SCD1在MM中的表达,及其在MM脂质代谢和细胞存活中的作用。方法:收集自2016年10月至2018年5月在华中科技大学同济医学院附属协和医院的16例多发性骨髓瘤患者骨髓标本和5例健康人外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞,实时PCR检测脂质合成基因SCD1表达水平,统计分析SCD1表达与MM临床特征的相关性;生物信息学分析比较126名初治骨髓瘤患者的CD138+MM细胞和18名骨髓瘤患者骨髓CD138-CD19+B细胞的SCD1表达;选取两个骨髓瘤细胞系RPMI8226和ARH77,免疫印迹法检测SCD1蛋白水平,BODIPY 493/503荧光染色检测细胞内脂滴(lipid droplets,LDs)的含量。si RNA-SCD1转染MM细胞敲降SCD1表达,检测SCD1对脂滴含量及MM细胞活性的影响,并分别补充外源性油酸(OA)或棕榈酸(PA),观察脂滴含量及MM细胞活性的变化。结果:在MM患者样本中,SCD1的表达明显高于健康供者,而其表达与患者、年龄或性别无相关性。生物信息学分析显示,初治骨髓瘤患者的CD138+MM细胞的SCD1表达高于患者骨髓中的CD19+B细胞。与正常B细胞相比,MM细胞系RPMI8226和ARH77中SCD1的表达显著升高,且MM细胞中的LDs含量高于正常B细胞。与对照组相比,si RNA-SCD1组细胞凋亡增加,并伴随LDs含量的明显降低。我们发现补充外源性油酸后OA+si RNA-SCD1组凋亡细胞比例较si RNA-SCD1组降低,而且细胞内LDs含量增加。结论:本部分研究表明,多发性骨髓瘤细胞中存在SCD1的高表达和脂质存储水平的增加,且SCD1的表达与MM临床分期相关,SCD1的表达影响MM细胞内脂滴含量和MM细胞存活能力,提示SCD1可能是干扰脂质代谢促进MM细胞凋亡的重要靶点。第二部分原人参三醇通过下调SCD1表达诱导内质网应激促进多发性骨髓瘤细胞凋亡目的:原人参三醇(PPT)是一种人参提取物,具有调节代谢紊乱和抑制脂质合成作用,在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用,而对MM细胞增殖、凋亡的作用尚不清楚。本部分研究探讨了原人参三醇对MM细胞生物学功能的影响和作用机制,及其在MM中对SCD1介导的脂质代谢的调控作用。方法:选取RPMI8226和ARH77两种多发性骨髓瘤细胞株,不同浓度原人参三醇作用于细胞,CCK8检测细胞活力和增殖,计算药物IC50,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期,western blotting检测凋亡蛋白、细胞周期相关蛋白表达。设置PPT干预组和DMSO组,q RT-PCR检测SCD1表达量,检测内质网应激相关基因XBP-1、GRP78、ATF4m RNA表达;western blotting检测SCD1和内质网应激凋亡通路相关蛋白p-PERK,PERK,CHOP的表达;补充油酸或棕榈酸,流式检测细胞凋亡,q RT-PCR和蛋白印迹检测上述蛋白的表达。免疫荧光检测PPT组和对照组细胞内LDs水平,并检测补充外源性油酸或棕榈酸后各组细胞细胞内LDs水平改变。结果:在RPMI8226和ARH77细胞系中PPT剂量依赖性抑制细胞活力和增殖。流式细胞术分析结果显示随着浓度的增加,PPT的促凋亡作用增强,细胞周期检测发现PPT诱导MM细胞周期在G0/G1期停滞。q RT-PCR和western blotting实验结果表明PPT显著下调MM细胞中SCD1的表达,补充棕榈酸的PA+PPT处理组细胞中SCD1的表达显著增加,而OA+PPT组细胞SCD1表达无显著改变。PPT降低了MM细胞中LDs水平,而油酸或棕榈酸的补充使细胞中LDs水平升高。细胞活力和细胞凋亡检测显示油酸的补充不仅补救了PPT处理的MM细胞的活力,而且部分逆转了PPT诱导的MM细胞凋亡。PPT诱导ER应激相关蛋白P-PERK和CHOP高表达,补充油酸逆转了PPT诱导的内质网应激。PPT和ER应激抑制剂TUDCA联合处理组细胞凋亡比例较PPT单独处理组减少,进一步证实PPT可诱导MM细胞ER应激相关细胞凋亡。结论:本实验研究结果表明原人参三醇具有抑制多发性骨髓瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。SCD1是饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的关键调节因子,PPT抑制SCD1的表达,下调细胞内LDs含量,干扰细胞脂质稳态,并进一步诱导MM细胞脂毒性相关内质网应激致细胞凋亡。第三部分体内实验验证原人参三醇抗多发性骨髓瘤的作用及机制目的:体外实验已证明原人参三醇通过干扰SCD1介导的脂肪酸合成抑制多发性骨髓瘤细胞增殖及活性的作用,体内实验进一步验证原人参三醇对多发性骨髓瘤的杀伤作用及机制。方法:在NOD/SCID小鼠中皮下注射RPMI8226细胞构建MM小鼠模型,设置PPT治疗组及PBS对照组,观察小鼠的生存状况,瘤体大小及体重变化;取小鼠瘤体,组织石蜡包埋切片标本,免疫组化染色检测Ki67(一种增殖能力的标志物)、凋亡蛋白裂解caspase3、SCD1的表达,免疫荧光检测SCD1、CHOP的表达。结果:与PBS注射对照组相比,PPT治疗组小鼠肿瘤生长显示出中度受抑制,且小鼠的体重明显低于对照组。取小鼠瘤体测量并计算肿瘤体积结果显示PPT治疗组的肿瘤体积明显较小。免疫荧光检测瘤体中SCD1、CHOP水平,我们观察到SCD1和ER应激之间存在显著的反向关系。用IHC染色来检测小鼠肿瘤组织中SCD1的表达结果显示与对照组相比,PPT处理的小鼠肿瘤样本SCD1的表达降低。此外,PPT治疗的肿瘤组织中Ki-67的表达水平降低,且凋亡蛋白裂解caspase3的表达水平升高。结论:小鼠体内实验验证PPT抑制MM瘤体生长,抑制脂质去饱和酶SCD1表达,诱导ER应激促进凋亡。
【图文】：

细胞存活,脂肪,棕榈酸,转导

30图 2 SCD1 是 MM 脂肪储存和细胞存活所必需。（A）RPMI8226和ARH77细胞用siRNA转染敲降SCD1，分为siRNA-SCD1组（50nM、100nM）和 SCR 对照组。在 siRNA 转导后第 3 天进行 western blot 分析以评估 SCD1的抑制作用。（B）补充 100μM 油酸（OA）或棕榈酸（PA）培养 SCD1 敲降（100nM）

细胞增殖,细胞

图 3 PPT 对 MM 细胞增殖和存活的影响。不同浓度（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml 和 50μg/ml）PPT 处理 RPMI8226和 ARH77 细胞 24h：（A）（B）CCK-8 法测定细胞增殖和活性，Annexin V /PI 染色并流式细胞术测定细胞凋亡；（C）流式细胞术测 PPT 处理组和对照组细胞的细胞周期（G0/G1 期、G2/M 期、S 期）；（D）收集细胞提取蛋白，，Western blotting 法检测凋亡蛋白 PARP、cleaved caspase3 和细胞周期蛋白 cdc25A、CDK2 和 cyclinA2 的表达。（E）PPT 处理 RPMI8226 和 ARH77 细胞，与 100μm 棕榈酸（PA）或油酸（OA）共培养24 小时，以 DMSO 处理的细胞作为对照。CCK-8 法检测细胞增殖和活性。（F）AnnexinV/PI 染色流式细胞术分析经处理的 RPMI8226 细胞的凋亡。图中所示数据均为三个独立实验的平均值±标准差。***P<0.001，*P<0.05，**P<0.01。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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