金丝小枣三萜类化合物的提取和鉴定以及抗前列腺癌活性研究

发布时间：2020-04-21 23:40

【摘要】：世界范围内,前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一,在男性所有恶性肿瘤中,前列腺癌发病率位居第二,严重危害了男性患者的健康。目前在我国肿瘤的预防和治疗过程中,中药在提高机体的免疫力、抑制肿瘤细胞的增殖和转移、促进肿瘤细胞调亡、逆转多药耐药性等方面均发挥着重要的作用。枣是鼠李科枣属植物枣树的果实。传统中医药认为,枣是一种药食同源的中药材,具有极高的营养和药用价值。我国枣的品种众多,枣类资源丰富,金丝小枣作为我国独有的品种,风味和营养尤佳。枣有抗焦虑、抗肥胖、抗氧化、抗炎、增强免疫力、保肝、抗癌等多种药理作用。研究表明,枣里面含有丰富的多糖、黄酮、酚酸、生物碱、环核苷酸、三萜类、维生素和矿物质等营养成分,其中有关多糖、黄酮、酚酸、环核苷酸等红枣生物活性成分的国内外研究居多,而有关枣中三萜的研究仅在国外有少数报道。鉴于我国红枣产地和种类的不同,其三萜的成分、含量、功效和作用机制均有所差异,故而,对我国重要红枣品种中三萜的研究,对于红枣高端功能食品和药品的开发至关重要。因此,本课题以乐陵金丝小枣为研究对象,摸索了乐陵金丝小枣中三萜的提取和纯化工艺,对其进行了成分分析和鉴定,并进一步研究了其对前列腺癌细胞的活性和作用机制。乐陵金丝小枣三萜的提取和纯化工艺研究包括提取和纯化工艺的比较以及提取和纯化工艺参数的考察,从而确定了较合适的提取和纯化条件。从诸种红枣三萜提取工艺中,我们筛选出了超声辅助的醇提法,并考察了提取过程中溶剂、时间和料液比等关键参数,对金丝小枣三萜的含量和收率的影响;而纯化技术则选择了碱溶酸沉法和萃取等纯化工艺。乐陵金丝小枣三萜的分析和鉴定采用了紫外分光光度法、反相高效液相色谱法(HPLC-DAD)和液质联用(LC-MS/MS)等分析和鉴定技术。所开发的HPLC-DAD和LC-MS/MS方法能同时分析和鉴定金丝小枣三萜类提取物中的7个三萜类化合物。在进行金丝小枣三萜的含量分析前,对所开发的HPLC方法学展开了验证,在各目标化合物标准曲线的线性范围内,线性相关系数均达到0.999以上,日内精密度和日间精密度的RSD值的范围分别是0.06～1.8%和0.14～1.5%,重复性试验和稳定性试验的RSD值均小于1.9%,加标回收率的范围在95.8%～102.6%之间,表明我们建立的分析方法准确、重现性好。定量分析结果表明,金丝小枣三萜类提取物中含量最高的成分是熊果酮酸(202.4 mg/g)和齐墩果酮酸(153.4 mg/g),齐墩果酸(59.7 mg/g)和熊果酸(48.0 mg/g)的含量次之。金丝小枣三萜的前列腺癌细胞的活性及作用机制研究,包括前列腺癌PC-3和LNCaP细胞模型的建立,对前列腺癌细胞的抑制率和细胞凋亡通路的考察。活性研究结果显示,乐陵金丝小枣三萜提取物能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖,且呈浓度依赖性和时间依赖性;对于PC-3细胞在48 h的抑制率为91.5%,IC50为21.2μg/mL 在LNCaP细胞上也显现出类似的趋势,在48 h的抑制率为69.6%,IC50为48.3 μg/mL。细胞周期研究表明金丝小枣三萜提取物能够增加前列腺癌PC-3细胞在G1期细胞数量,减少S期和G2/M期细胞数量,这提示有可能通过此阻断细胞周期进程;另外,caspase8、caspase3和caspase9的含量均随着金丝小枣三萜提取物的浓度增大而增加,继而激活内源性途径和外源性途径,来诱导细胞凋亡。综上所述,本课题以我国主要红枣产区的乐陵金丝小枣为研究对象,首先探索了乐陵金丝小枣中三萜的提取和纯化工艺技术及其关键参数;然后对三萜成分进行了定性和定量分析测试,其数据表明我国乐陵金丝小枣中三萜的种类和含量与其他大枣品种的有所差异;最后,研究了乐陵金丝小枣三萜提取物对前列腺癌PC-3和LNCaP细胞的抑制活性及作用机制,其结果显示,我国乐陵金丝小枣三萜对所研究的前列腺癌细胞具有较强的抑制作用,且可以通过激活内源性细胞凋亡途径和外源性细胞凋亡途径来抑制前列腺癌细胞的增殖。因此,本课题的初步研究结果揭示了金丝小枣三萜类提取物具备成为前列腺癌新型治疗药物的可能性,并且其研究结果为进一步开发红枣三萜类化合物提供了具有较高实用价值的实验技术和方法学。
【图文】：

齐墩果酸,长扫描,全波,显色

３．１．２标准曲线的制备逡逑齐墩果酸标准品的吸光度测定结果见表２－１，以吸光度Ａ对浓度Ｃ绘制回归逡逑曲线（见图２－２），在０？２０邋ｐｇ／ｍＬ范围内呈线性相关。回归方程为：逡逑Ｙ＝０．０３３６ｘ＋０．００８５逦Ｒ２＝０．９９９５。逡逑

齐墩果酸,对照品,三萜,提取溶剂

３．２．１提取溶剂的影响逡逑用甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯这几种溶剂来提取，实验结逡逑果如表２－２和图２－３所示，从实验数据可知，用三氯甲烷和二氯甲烷作为提取溶逡逑剂，提取物中总三萜的含量较高，分别为１１．９５±０．４５％和１５．７６±０．５１％，但是从逡逑总三萜粗品的得率来讲，用甲醇和乙醇作为溶剂时更高，这几种溶剂中，其中乙逡逑醇的总三萜粗品得率最高，为３８．６４±２．６５％。且乙醇更经济环保，，因此，选择乙逡逑醇作为提取溶剂更合适。逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

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