文冠果皂苷E钠盐的抗乳腺癌活性及其毒性的初步研究

发布时间：2020-04-22 13:55

【摘要】：目的:文冠果皂苷E(皂苷E)是一种丰富地存在于文冠果果壳和果柄中的具有显著生物活性的玉蕊醇型三萜皂苷,经过其他学者和课题组前期的研究,发现其具有很强的抗肿瘤活性。为了提高其溶解度,本研究对皂苷E进行了结构改造,将其制备成钠盐。利用4T1乳腺癌小鼠模型对皂苷E的钠盐进行抗肿瘤活性的体内药效学验证,同时为了证明其对人乳腺癌的功效,引入MCF-7人乳腺癌细胞系作为细胞实验的研究对象。在药物安全性方面对皂苷E的急性毒性实验及溶血性进行了初步的评价和探讨,旨在为后续皂苷E的成药研究提供借鉴与参考。方法:将皂苷E与等摩尔量的NaOH进行化学反应得到皂苷E的钠盐。然后分别测定皂苷E及其钠盐抗4T1乳腺癌细胞系的IC_(50)值。通过比较验证皂苷E钠盐的抗肿瘤活性。利用4T1乳腺癌细胞和Balb/c小鼠构建4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型,将其随机分配为模型组(生理盐水),阳性药组即盐酸阿霉素组(5mg·kg~(-1)),低剂量皂苷E钠盐组(0.5mg·kg~(-1))及高剂量皂苷E钠盐组(1.0mg·kg~(-1)),各组每间隔2天给一次药,持续给药5次,最后一次给药后24小时,将各组小鼠颈椎脱臼处死,取出小鼠的皮下肿瘤组织,进行瘤体称重,计算小鼠肿瘤抑制率及肿瘤体积。通过对4T1荷瘤小鼠肿瘤肿块的重量和体积的比较评价皂苷E钠盐的肿瘤抑制活性。继续引入MCF-7人乳腺癌细胞系作为细胞实验的研究对象,利用CCK-8法测定细胞毒性,Western blot检测不同浓度皂苷E钠盐对MCF-7细胞凋亡蛋白表达的影响。毒性试验选用阶梯法和Bliss法来测定半数致死量(LD_(50))。阶梯法选用SPF级健康雌性昆明种小鼠13只,以1 mg·kg~(-1)为起始剂量,相邻剂量比为1:0.7,给药方式为尾静脉注射,遵循《化学药物急性毒性试验技术指导原则》进行试验。Bliss法选用SPF级健康雌性昆明种小鼠42只,随机分为7组,每组6只,设定6个剂量组(4.08、5.83、8.33、11.90、17.00、24.28 mg·kg~(-1))和空白对照组,给药方式为尾静脉注射,给药一次后,连续观察14天,记录各组小鼠的存活情况,运用Bliss法计算LD_(50),检测存活小鼠的生理生化指标,对小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏等主要脏器进行病理切片观察。溶血实验取SPF级健康雌性家兔,经动脉插管取血并制备2%血细胞悬浮液,设定10个剂量组(0.16、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00μg·ml~(-1)),按照2015版《中华人民共和国药典》“溶血与凝聚检查法”指导通则进行溶血实验。结果:经过红外光谱的鉴定,皂苷E钠盐结构改造的位点为葡萄糖醛酸的羧基上的活泼氢,并没有使其官能团发生改动。通过皂苷E与其钠盐对4T1乳腺癌细胞的IC_(50)值进行比较,发现二者对4T1乳腺癌细胞的抗肿瘤活性无显著性差异。皂苷E钠盐对4T1乳腺癌小鼠模型的实验结果显示:无论是从重量上还是从体积上,给药组明显低于对照组,且表现出了与阳性药阿霉素相近的抑制作用,但是对于小鼠体重的影响较阿霉素小。MCF-7细胞实验中,皂苷E钠盐IC_(50)值为5.33μM,随着浓度的增大,MCF-7增殖减弱,细胞抑制率明显升高(P0.05),且呈现出剂量依赖性。采用Western blot技术检测凋亡因子的表达,结果显示与空白对照组相比,随着给药浓度的增加,MCF-7细胞促凋亡蛋白BAD的表达水平降低(P0.05),而促凋亡蛋白Caspase-3表达水平升高(P0.05)。同时促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值呈现上升趋势。急性毒性研究结果显示:皂苷E钠盐静脉注射的LD_(50)值为8.35 mg·kg~(-1),组织切片和生化指标检测结果表明,皂苷E钠盐能诱导肝窦充血与肾小管上皮细胞变性;能够诱导GOT和Cr异常升高。皂苷E钠盐在0.63μg·ml~(-1)的浓度表现出较强的溶血性,其安全剂量应为0.31μg·ml~(-1)以下。结论:钠盐的改造在解决皂苷E水溶性比较差的问题的同时对其抑制肿瘤细胞的活性并没有明显影响。将皂苷E改造成钠盐能够显著提高其水溶性,使其能够作为注射剂给药,结果表明钠盐的细胞毒活性并没有降低。所以我们初步认为在研究皂苷E的抗肿瘤活性及其机制研究的过程中,皂苷E的钠盐可以代替皂苷E进行活性研究。通过进行体内外的药效学验证,发现皂苷E钠盐具有明显的抗乳腺癌活性。同时皂苷E钠盐的安全阈值较低,溶血活性极强,体内毒性主要表现为肝毒性与肾毒性。溶血活性与其毒性有一定联系,在新药研发上,还需要对其结构及性质加以改变,以提高其安全性。以上实验为后续皂苷E的成药研究提供了借鉴与参考。
【图文】：

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图 1.1C 文冠果皂苷 E 结构改造果皂苷 E 与其钠盐的活性对比察改造前后化合物与目标产物对肿瘤细胞的抑制活性是否存有差外细胞毒活性的对比研究。通过皂苷 E 与其钠盐对 4T1 肿瘤细胞（见图 1.2），得出皂苷 E 的 IC50值为 44.24μM，其钠盐的 I发现二者活性无显著差异。皂苷 E皂苷 E 钠盐

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图 1.1C 文冠果皂苷 E 结构改造3.2 文冠果皂苷 E 与其钠盐的活性对比为了考察改造前后化合物与目标产物对肿瘤细胞的抑制活性是否存有差异，我们进行了体外细胞毒活性的对比研究。通过皂苷 E 与其钠盐对 4T1 肿瘤细胞的 IC50值进行比较（见图 1.2），，得出皂苷 E 的 IC50值为 44.24μM，其钠盐的 IC50值为40.13μM，发现二者活性无显著差异。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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