雷公藤治疗肾炎有效部位及雷公藤甲素抗炎活性的比较研究

发布时间：2020-04-23 20:31

【摘要】：雷公藤(Tripterygium wilforiiHook.f.,TWHF)为卫矛科植物,其根、叶、花、芽及果均有毒性。体内外试验和临床试验均已发现,雷公藤提取物具有明显的抗炎抗感染、免疫抑制和免疫调节以及抗肿瘤等功效,被广泛应用于治疗炎症性疾病、免疫系统性疾病以及肿瘤等。由于造成雷公藤毒副作用的主要化学成分往往也是造成其生物活性的主要成分,且该药材的毒性与活性均与其所含主要化学成分含量具有密切关联性;同时,市售雷公藤制剂由于生产厂家、制剂配方和生产工艺不同,造成各制剂所含活性成分含量、活性以及毒性均存在较大差异,因此局限了雷公藤的临床应用。为了优化雷公藤药材的入药部位和生长年限,达到减毒增效的目的,本文构建针对慢性肾炎的体外细胞模型并采纳中药材有效部位概念,综合提取工艺和所含代表性化合物的含量检测分析,筛选泰宁地区雷公藤药材,获得更为合理和经济的药材提取物和有效部位提取物;研究雷公藤甲素和所选雷公藤有效部位对LPS刺激后的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7的抗炎作用及其可能涉及的作用机理、对小鼠的急性毒性以及对C-BSA肾炎小鼠的药效,初步分析所选雷公藤有效部位提取物所含代表性活性成分之间是否存在药物相互作用。主要研究工作如下:(1)为了优化雷公藤药材的入药部位和生长年限,以人正常肝细胞HL-7702、小鼠巨噬细胞系RAW 264.7以及大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1为研究对象,对2-7年限的雷公藤含皮根茎以及去皮根茎乙醇提取物的生物活性进行体外实验,通过比较IC50/EC50比值,建议雷公藤入药不一定选择生长年限更长的药材,且选择含皮根茎可能更加合理和经济。同时,采纳中药材有效部位概念,综合提取工艺和所含代表性活性化合物含量检测分析,通过比较IC50/EC50比值,初步筛选出雷公藤二萜+生物碱部位(简称为二加生有效部位,下同)作为雷公藤治疗肾炎有效部位提取物。(2)研究了雷公藤甲素对LPS刺激的RAW 264.7的抗炎效应及其作用机制。结果发现,雷公藤甲素可以时间和浓度依赖性的抑制RAW 264.7的细胞活力;下调NO和TNF-αα的生成水平,降低iNOS、COX-2、TLR4、p-ERK和p-p38的蛋白表达水平,下调NF-κBp65和IκB-α的活性,且具有浓度依赖性。这说明,雷公藤甲素通过参与调控MAPK信号通路以及NF-κB信号通路,从而可以浓度依赖性的抑制TLR4蛋白水平以及降低促炎因子的表达水平,进而发挥其抗炎作用。(3)研究了雷公藤二加生有效部位提取物对LPS刺激的RAW 264.7的抗炎效应及其作用机制。结果发现,与雷公藤甲素的抗炎作用机理略有不同,雷公藤二加生有效部位提取物可以浓度依赖性的抑制LPS诱导的TAK1和TLR4的蛋白高表达水平,干扰MAPK信号通路和NF-kB信号通路,进而抑制LPS诱导的促炎因子高表达水平,发挥其抗炎作用。另外,含有相同质量雷公藤甲素的雷公藤二加生有效部位对RAW 264.7的生物活性和用药安全性方面要优于雷公藤甲素单独用药,这表明雷公藤二加生有效部位中含有的三种活性成分(雷公藤甲素、雷公藤红素和雷公藤次碱)和其他化学成分之间存在药物相互作用,从而提高其抗炎作用。(4)研究了雷公藤甲素和雷公藤二加生有效部位对小鼠的口服给药急性毒性以及分别灌胃给药4周对C-BSA肾炎小鼠的药效。结果发现,雷公藤甲素的LD50为1.077mg/kg(95%置信限为0.886-1.297mg/kg),雷公藤二加生有效部位的LD50为1.211 mg/kg(95%置信限为1.099-1.323 mg/kg),雷公藤二加生有效部位的LD50高于雷公藤甲素,表明其对小鼠的急性毒性要弱于雷公藤甲素。雷公藤甲素(200 μg/kg)和雷公藤二加生有效部位(500 μg/kg)分别给药4周都可以明显改善C-BSA肾炎小鼠的病理变化,降低其24小时尿蛋白含量、血清BUN和Cr水平但对ALT和AST的活性水平没有明显影响。表明雷公藤甲素(200 μg/kg)和雷公藤二加生有效部位(500μg/kg)均可以对C-BSA肾炎小鼠发挥其抗炎作用且不会造成明显肝毒性。综上所述,采纳中药材有效部位概念,综合提取工艺和所含代表性活性化合物含量检测分析,通过比较ICso/ECso比值,初步筛选出雷公藤二加生有效部位作为雷公藤治疗肾炎的有效部位提取物。含有相同质量雷公藤甲素的雷公藤二加生有效部位提取物对RAW 264.7的生物活性及其作用机制的体外研究结果、小鼠急性毒性研究结果和对C-BSA肾炎小鼠的体内药效研究结果均表明其抗炎效应强于雷公藤甲素单独用药,并对该药材的减毒增效提供新思路。
【图文】：

Ｋｕｐｃｈａｎ等人于１９７２年首次从雷公藤属植物的根部中分离、纯化并鉴定为雷公逡逑藤甲素［Ｗ。雷公藤甲素（Ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ，ＴＰ）又称为雷公藤内醋醇，属于二萌类化合物，逡逑是雷公藤含有的一个重要代表性活性化合物。其化学结构见图１．１所示，分子式为逡逑Ｃ２０比４0６，分子量为３６０．４，，其最大吸收波长为２１８ｎｍ。逡逑如、、但逦／＂逡逑＇一逦１０逦Ｓ、逡逑Ａ邋Ｂ邋Ｔｏ逡逑图１．１雷公藤甲素化学结构示意图ＩＩＤ］逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋Ｓ化ｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐＵ）ｌｉｄｅ逡逑Ｚｈｏｕ等人对雷公藤甲素的化学结构、生物活性及其临床应用进行总结后发现，逡逑雷公藤甲素在１９７８年最初被用于临床治疗白血病，后相继用于与免疫系缔有关的多逡逑种疾病的体内外实验和临床试验中。雷公藤甲素具有多种生物活性ＵＵ。如图１．２所示，逡逑诸如抗炎抗感染、免疫抑制和免疫调节、抗生育和抗肿瘤等。迄今为止，雷公藤甲逡逑素己被广泛用于治疗各种丯脏疾病，具有较好的疗效。但由于雷公藤甲素的毒副作逡逑２逡逑

Ｆｉｇ．１．３邋Ｐｒｏｐｏｓｅｄ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆＴｈｌ？邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ逡逑辅助性Ｔ细胞１７邋（Ｔ邋ｈｅｌｐｅｒ邋１７，邋Ｔｈｌ７）是ＣＤ４叮淋巴细胞的一个独有亚群【４８＾。逡逑如图１．３所示，Ｔｈｌ７细胞可特征性分泌促炎因子忙－１７邋（主要是ｍ－１７Ａ和比－１７Ｆ），逡逑其分化成熟需要转录因子视黄酸相关孤儿受体伸Ｒｅｔｉｎｏｉｃ邋ａｃｉｄ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ｏｒｐｈａｎ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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