向日葵茎芯多糖抗肺癌转移的活性与机制研究

发布时间：2020-04-28 00:43

【摘要】：向日葵(Helianthus annuus L.)的茎芯的水提液在我国被用于治疗晚期恶性肿瘤,表明向日葵的茎芯的水提液含有抗肿瘤的活性物质。在寻找向日葵茎芯中抗肿瘤活性物质的过程中,向日葵茎芯多糖被筛选出。并首先对向日葵茎芯多糖的结构以及抗肺癌转移活性与作用机制进行了研究。主要研究结果如下:1.向日葵茎芯多糖(HALWP)的制备:首先通过水提醇沉法提取向日葵茎芯多糖,提取所得粗多糖利用Sevag法除去蛋白、活性炭法除去色素后,上DE-52离子交换层析柱进行分离,得到四个洗脱峰(HALWP1、HALWP2、HALWP3、HALWP4)。将抗肿瘤活性最强的HALWP4上葡聚糖Sephadex G-200层析柱,再次分离得到四个洗脱峰(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3 和 HALWP4-4),它们的得率分别占 HALWP4的2.09%、2.06%、3.05%和0.66%。HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4通过高效凝胶排阻色谱检测其平均分子质量分别为6.85×105 Da,5.42×105 Da,1.66×105Da,1.03×105Da。2.向日葵茎芯多糖的结构初步解析:将向日葵茎芯多糖进行完全水解,经衍生化后质谱分析,结合红外光谱及生源推测组成向日葵茎芯多糖的单糖为β-D-甘露糖、β-D-甘露糖醛酸、β-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖醛酸、β-D-半乳糖或β-D-半乳糖醛酸这三种单糖或其醛酸的一种单糖醛酸或若干种单糖及单糖醛酸,且一定量的单糖通过甘油与脂肪酸共价结合。将HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4进行完全水解,经衍生化后质谱分析,结合红外光谱及生源推测组成HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4的单糖为β-D-甘露糖、β-D-甘露糖醛酸、β-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖醛酸、β-D-半乳糖或β-D-半乳糖醛酸这三种单糖或其醛酸的一种单糖醛酸或若干种单糖及单糖醛酸,且一定量的单糖通过甘油与脂肪酸或有机酸共价结合。3.HALWP4体外抗肿瘤活性:①采用集落形成实验对HALWP4的体外抗肿瘤活性进行了研究:使用4.0 mg/mL的不同种多糖处理小鼠肺癌LLC细胞,同空白组相比给药组的集落形成的数目显著的减少,空白组细胞数为2×106个,HALWP4-1给药组的抑制集落形成率为52.17±0.75%,HALWP4-2给药组的集落形成抑制率为56.52土1.23%,HALWP4-3给药组的集落形成抑制率为65.21 ± 0.98%,HALWP4-4给药组的集落形成抑制率为69.56±1.34%,n=3,P0.05。②通过MTT法对HALWP4中抑制肿瘤集落形成最强的HALWP4-4进行体外抑制肿瘤细胞增殖的能力进行评估:4.0 mg/mL的HALWP4-4对人类胃癌细胞SGC-7901、人类肝癌细胞L-02以及人类口腔上皮癌细胞KB的IC50值分别为3.978±0.079 mg/mL、4.871±0.044 mg/mL、6.871±0.079 mg/mL,n=3,P0.05。结果表明 HALWP4-4 体外抑制肿瘤细胞的增殖能力较弱,不足以解释向日葵茎芯的水提液在临床上具有较强抗癌活性。4.向日葵茎芯多糖体外抗肿瘤转移活性:①采用Transwell趋化小室测定向日葵茎芯多糖抑制肿瘤细胞迁移的研究:空白组中细胞迁移个数为320个,4.0 mg/mL的向日葵茎芯多糖(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4)均具有抑制小鼠肺癌细胞LLC迁移的作用,四个给药组细胞迁移率分别为 90.63±0.49%、75.00±1.32%、40.63±1.07%、25.00±0.99%,n=3,P0.05。其中HALWP4-4的抑制肿瘤细胞迁移效果最为显著。②采用划痕实验测定向日葵茎芯多糖抑制肿瘤细胞迁移的研究:实验结果表明,空白组、4.0 mg/mL的向日葵茎芯多糖(HALWP4-1组、HALWP4-2组、HALWP4-3组和HALWP4-4 组)的愈合率分别为 23.05±0.58%、17.25±1.97%、13.86土0.98%、9.07 ±2.03%、6.90±0.51%,n=3,P0.05。向日葵茎芯多糖四个组分(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4)均具有抑制小鼠肺癌细胞LLC转移的能力,且HALWP4-4组抑制小鼠肺癌细胞LLC转移的能力最强。5.向日葵茎芯多糖抗肿瘤转移机制:①通过测定抑制小鼠巨噬细胞Raw264.7释放NO含量模型研究向日葵茎芯多糖抗炎能力。4.0 mg/mL HALWP4-1 组,4.0 mg/mL HALWP4-2 组,4.0 mg/mL HALWP4-3 组以及 4.0 mg/mL HALWP4-4 组其 NO 含量分别为,11.35±0.21 μmoL/gprot、7.89 ±0.39 μmoL/gprot、7.69±0.17 μmoL/gprot、7.57±0.18 μmoL/gprot,n=3,P0.05。其NO含量均随着药物浓度的升高而降低,因此向四组日葵茎芯多糖(HALWP4-1、HALWP4-2、HALWP4-3和HALWP4-4)均具有抗炎活性,且HALWP4-4组效果最强。②采用ELISA试剂盒检测向日葵茎芯多糖不同组分对小鼠巨噬细胞Raw264.7分泌TNF-α 的量的影响。空白组、4.0 mg/mL 的 HALWP4-1 组、HALWP4-2 组、HALWP4-3组和 HALWP4-4 组的 TNF-α 的浓度分别为 179.26±10.52 pg/mL、166.70±9.78 pg/mL、175.06±10.65 pg/mL、173.51±9.33 pg/mL 和 1.68.24±9.82 pg/mL。综上所述,向日葵茎芯多糖具有抗肿瘤及抑制肿瘤转移的活性。另外,向日葵茎芯多糖具有抗炎作用,且抑制小鼠巨噬细胞TNF-α的释放。因此结合向日葵茎芯多糖的结构特点推测向日葵茎芯多糖抗肺癌转移作用机制是:水溶性的向日葵茎芯多糖通过其长链脂肪酸与肺癌肿瘤微环境的巨噬细胞的Toll 2受体(TLR2)附近的细胞膜结合,干扰了肺癌肿瘤细胞释放的多功能糖蛋白与巨噬细胞的Toll 2受体(TLR2)结合从而减少了巨噬细胞释放TNF-α,最终抑制肺癌转移。本研究为向日葵茎芯多糖开发为高效低毒的抗肿瘤药物打下了坚实的理论和实践基础。
【图文】：

洗脱曲线,多糖,向日葵,洗脱曲线

逑２．７．２邋ＤＥ－５２离子交换柱层析法分离多糖逡逑如图２－２所示，通过ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ＤＥ－５２层析柱得到四个粗多糖组分，采用苯逡逑酚－硫酸法，波长为４９０邋ｎｍ处测定其０Ｄ值，洗脱曲线如图２－２所示，通过０．１邋Ｍ、０．２逡逑Ｍ、０．３邋Ｍ和０．４邋Ｍ的ＮａＣｌ溶液洗脱后各自出现一个洗脱峰。将洗脱后得到的各产物逡逑浓缩到适当体积后，透析３６邋ｈ纯化。ＨＡＬＷＰ－１占多糖的３．０３％、ＨＡＬＷＰ－２占多糖的逡逑４．１９°／。、ＨＡＬＷＰ－３邋占多糖的邋１．８２％，ＨＡＬＷＰ－４邋占多糖的邋０．９６°／0。逡逑１．0１逡逑ＩＩ邋°－８；邋Ａ逡逑ＩＩ邋０．６－邋ｍ邋ｐ邋ｆ＼逡逑ｉｉ０Ａ：［＼邋ｌ）邋ｒ逡逑＜邋°－２－Ｊ邋ｉ！邋［邋Ｊ邋＼邋ｉ＼逡逑Ｑ．Ｏｆ逦■■逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逡逑管数逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｔｕｂｅｓ逡逑图２－２向日葵

洗脱曲线,乙酰化衍生物,总离子流,多糖

逑２．７．２邋ＤＥ－５２离子交换柱层析法分离多糖逡逑如图２－２所示，通过ＤＥＡＥ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ＤＥ－５２层析柱得到四个粗多糖组分，采用苯逡逑酚－硫酸法，波长为４９０邋ｎｍ处测定其０Ｄ值，洗脱曲线如图２－２所示，，通过０．１邋Ｍ、０．２逡逑Ｍ、０．３邋Ｍ和０．４邋Ｍ的ＮａＣｌ溶液洗脱后各自出现一个洗脱峰。将洗脱后得到的各产物逡逑浓缩到适当体积后，透析３６邋ｈ纯化。ＨＡＬＷＰ－１占多糖的３．０３％、ＨＡＬＷＰ－２占多糖的逡逑４．１９°／。、ＨＡＬＷＰ－３邋占多糖的邋１．８２％，ＨＡＬＷＰ－４邋占多糖的邋０．９６°／0。逡逑１．0１逡逑ＩＩ邋°－８；邋Ａ逡逑ＩＩ邋０．６－邋ｍ邋ｐ邋ｆ＼逡逑ｉｉ０Ａ：［＼邋ｌ）邋ｒ逡逑＜邋°－２－Ｊ邋ｉ！邋［邋Ｊ邋＼邋ｉ＼逡逑Ｑ．Ｏｆ逦■■逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逡逑管数逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｔｕｂｅｓ逡逑图２－２向日葵
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

【参考文献】