纳豆激酶体内药效和毒性研究

发布时间：2020-05-08 00:01

【摘要】：纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto),在纳豆发酵过程中产生的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶。研究表明纳豆激酶不仅易于提取纯化,成本低廉,溶栓效果好,药效时间长,而且安全性好,为解决目前抗血栓类药物的口服性差,价格昂贵、并发症多等问题带来更多希望。本文通过应用实验室分离到的高产纳豆激酶菌株(Bacillus subtilis natto LNUB236)经过发酵培养,以发酵液为原料,采用硫酸铵沉淀纳豆激酶,将离心后的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解,得到的纳豆激酶粗酶液,进行两次Sephadex G-75凝胶层析,收集到的纳豆激酶活性组分经过冷冻干燥得到冻干粉,并定量将冻干粉装入大鼠专用肠溶胶囊,以口服纳豆激酶肠溶胶囊的给药方式来评价纳豆激酶在体内的药效作用、体内急性毒性和长期毒性,为纳豆激酶的临床应用和产品开发提供相应的理论基础。纳豆激酶抗血栓的作用评价是通过构建SD大鼠体内血栓模型以及对小鼠尾部出血时间的影响进行评价。体内药效表明,FeCl_3诱导的大鼠颈动脉血栓实验中,与对照组相比,纳豆激酶5000 IU/kg、10000 IU/kg、15000 IU/kg剂量组均能够有效抑制大鼠颈动脉血栓的形成(P0.0001),且具有剂量依赖性。在小鼠尾部出血实验中,与对照组相比,5000 IU/kg、10000 IU/kg、15000 IU/kg剂量组均能显著延长出血时间(P0.0001),且随着给药剂量的增加出血时间更长(P0.0001),具有剂量依赖性。观察纳豆激酶对SD大鼠的急性毒性和长期毒性,为临床用药安全提供参考。纳豆激酶急性毒性实验中,一次给药5000 mg/kg,并连续观察14天,记录毒性反应和死亡情况。急性毒性实验中无毒性反应和死亡发生,实验结果表明纳豆激酶的LD_(50)5000 mg/kg,无急性中毒的危险性。在长期毒性实验中,观察大鼠重复28天给予纳豆激酶毒性反应,将大鼠随机分成4组,分别为对照组、纳豆激酶120 mg/kg、360 mg/kg、1000 mg/kg给药剂量组,重复给药28天,试验期间每天观察大鼠的外观体征、行为活动,并在实验结束采集血样进行血液学、血液生化学、凝血指标及病理组织学检查。纳豆激酶重复给药28天,给药期间大鼠生长发育良好,行为活动正常,各项指标检测均未发现异常,本实验中未发现与纳豆激酶毒性相关的异常改变,纳豆激酶经口服给药28天对大鼠无明显毒性。纳豆激酶重复给药90天的毒性实验中,大鼠随机分为4组,分别为对照组、纳豆激酶120mg/kg、360 mg/kg、1000 mg/kg给药剂量组,重复给药90天,给药期间观察大鼠的一般状态,给药结束后大鼠分别进行血液学、血液生化学、凝血指标和病理组织检查。实验期间各给药组大鼠的外观体征,行为活动,粪便等均正常,各项指标检查均未发现异常。本实验条件下,未发现纳豆激酶毒性引起的异常改变,纳豆激酶经口给药90天对大鼠无明显毒性。
【图文】：

标准曲线,酶活,标准曲线,尿激酶

第 1 章纳豆激酶的制备实验结果.1 酶活标准曲线的绘制纳豆激酶活性是折算成尿激酶的活性单位表示的，以尿激酶活性为横坐标，蛋白平板溶解圈面积的对数为纵坐标，绘制酶活标准曲线。实验得到的尿激性和溶解圈直径乘积的对数如表 1-2所示。表 1-2 酶活标准曲线激酶酶活(IU/mL) 20 40 60 80 100 160 320径乘积的对数 2.13 2.18 2.17 2.22 2.23 2.32 2.52以尿激酶活性为横坐标，，溶解圈直径乘积的对数为纵坐标，绘制酶活标准曲如图 1-1 所示。

纳豆激酶,凝胶层析,图谱,纤溶活性

一次Sephadex-G-75凝胶层析图谱
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】