白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌细胞膜、细胞壁和液泡的作用及机制研究

发布时间：2020-08-19 10:44

【摘要】：目的:探讨白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌细胞膜、细胞壁和液泡的作用及机制。方法:首先采用微量液基稀释法检测白头翁汤正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of BaiTouWeng decoction,BAEB)对白念珠菌的MIC_(80)和SMIC_(80)。针对白念珠菌细胞膜,通过spot assay观察BAEB对白念珠菌细胞活性的影响;通过酶标仪检测白念珠菌细胞内甘油含量以反映白念珠菌细胞内渗透压的变化;qRT-PCR定量检测白念珠菌细胞内渗透压相关基因的表达;通过荧光显微镜观察BAEB对白念珠菌细胞膜通透性的影响;通过高效液相测定白念珠菌细胞膜中麦角甾醇的含量;qRT-PCR定量检测白念珠菌细胞膜麦角甾醇合成相关基因的表达。针对白念珠菌细胞壁,Spot assay检测BAEB、荧光白(Calcofluor white,CFW)、刚果红(Congo red,CR)对白念珠菌细胞活性的影响;流式细胞仪和酶标仪检测BAEB对白念珠菌细胞壁β-1,3-葡聚糖的影响;流式细胞仪检测BAEB对白念珠菌细胞壁几丁质的影响;qRT-PCR检测白念珠菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成相关基因及几丁质合成相关基因的表达;透射电镜观察白念珠菌细胞壁。针对白念珠菌液泡,通过荧光显微镜观察BAEB对白念珠菌液泡膜的影响;qRT-PCR定量检测BAEB对白念珠菌液泡合成相关基因表达的影响。结果:256、512、1024μg/mL BAEB干预下白念珠菌的菌落数逐渐减少,活性逐渐降低;512、1024μg/mL BAEB组白念珠菌胞内甘油含量分别为444.64±0.9nmol/mg、571.93±4.3 nmol/mg,和空白对照组相比甘油含量显著性增多(P0.05),256、512、1024μg/mL BAEB组白念珠菌细胞内渗透压的相关基因HOG1分别下调了9.1倍、9.3倍、5.5倍;512、1024μg/mL BAEB组白念珠菌产生红色荧光的细胞显著增多;1024μg/mL BAEB干预后麦角甾醇峰面积为35.88495,与空白对照组对比有显著性差异(P0.05);1024μg/mL BAEB干预组白念珠菌细胞膜麦角甾醇合成相关基因ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG10、ERG11、ERG13、ERG24、ERG25、ERG251、ERG26与UPC2分别下调了6.57、4.88、4.14、9.23、3.40、9.83、3.07、7.49、5.52、5.89、2.44、3.24、1.97、10.06倍。刚果红、荧光白和BAEB组分别与白念珠菌空白对照组相比,活性均降低;256、512、1024μg/mL BAEB组白念珠菌细胞壁β-1,3-葡聚糖与几丁质暴露逐渐增多(P0.05);1024μg/mL BAEB干预组FKS1、CHS1、CHS2、CHS3、CHS8等β-1,3-葡聚糖与几丁质合成相关基因分别下调5.57、2.96、3.29、4.47、3.00倍;透射电镜观察BAEB干预后白念珠菌细胞壁的结构有破损且电子密度小,细胞壁溶解。通过酵母液泡膜染料MDY-64染色,随着BAEB浓度的增高白念珠菌液泡膜产生的绿色荧光显著减少,呈剂量依赖的特征,液泡膜破损;1024μg/mL BAEB干预组APM1、CLA4、PEP7、PEP12、PKH2、VPS15、VPS34、VPS41、YPT72等液泡合成相关基因分别下调4.410、4.534、4.070、2.184、4.506、11.435、11.316、3.192、2.372倍。结论:以上结果表明BAEB可能通过使细胞膜结构破损,细胞膜关键组分含量减少,进而破坏白念珠菌细胞膜的完整性从而抑制白念珠菌细胞的活性,同时可以抑制白念珠菌细胞膜麦角甾醇合成相关基因的表达,减少麦角甾醇的合成。BAEB可使白念珠菌细胞壁β-1,3-葡聚糖及几丁质暴露从而破坏细胞壁的结构。同时可通过抑制β-1,3-葡聚糖、几丁质生物合成相关基因的表达,进而破坏细胞壁的结构,影响白念珠菌细胞壁完整性。BAEB可损伤白念珠菌液泡膜及下调白念珠菌液泡合成相关基因。本研究为研发新型抗真菌药物及抗真菌机制的阐明提供实验依据。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

图 1 .BAEB 对白念珠菌细胞活性的影响Fig 1. Effect of BAEB on activity of C.albicans3.3 BAEB 对白念珠菌细胞内渗透压及渗透压相关基因的影响按照南京建成生物工程研究所甘油含量测定试剂盒说明书检测胞量，空白对照组、256、512、1024 μg/mLBAEB 组和 FLZ 组吸光度分别0.193、0.194、0.18、0.173，依据甘油标准品标准曲线 y=0.0002x+0.066白对照组、256、512、1024 μg/mLBAEB 组和 FLZ 组胞内甘油总量分别633.5、638.5、568.5、533.5 μmoL/L。按照碧云天蛋白检测试剂盒方法蛋白总量，空白对照组、256、512、1024 μg/mLBAEB 组和 FLZ 组吸光1.923、1.832、1.759、1.686、1.747，依据蛋白标准品标准曲线 y=0.16

2. BAEB 对白念珠菌细胞膜胞内渗透压的影响及渗透压相关基因 HOG1 和 RHR2 的表达*.P<0.05；**.P<0.01）ig 2. Effect of BAEB on intracellular osmotic pressure of C.albicans and expression of osmoticressure-associated genes HOG1 and RHR2（*.P<0.05；**.P<0.01）.4 BAEB 对白念珠菌细胞膜通透性的影响通过荧光显微镜观察，白念珠菌产生红色荧光的强度随着 BAEB 浓度的增加逐渐增强，空白对照组的白念珠菌产生红色荧光最少且最弱，1024 μg/mL BAEB白念珠菌产生红色荧光最多且最强。（如图 3A1-E1）。菌株荧光图相对应的明

BAEB对白念珠菌细胞膜通透性的影响（400×）

【参考文献】

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本文编号：2796993