槲皮素对骨性关节炎的作用及其机制研究

发布时间：2020-09-19 16:50

　　 前言骨关节炎(OA)是一种全世界范围内影响患者疼痛和功能的慢性退行性关节疾病,随着年龄增加其发病率也不断上升,对我国的医疗、经济和社会造成了严重负担。骨关节炎的病理变化主要有以下几点:(1)软骨细胞出现凋亡、(2)软骨基质遭到破坏、(3)软骨下骨骨化、骨赘形成、(4)滑膜产生炎症反应。其发病机制迄今为止尚未明确,因而限制了骨关节炎的治疗手段。早期骨关节炎以口服药物为主,如非甾体抗炎药(NSAIDs),但NSAIDs类药物因对胃肠道及心血管具有一定的毒副作用,对患者的身体健康具有隐患,因而影响了其在骨关节炎治疗中的应用。槲皮素(Quercetin,QUE),是一种广泛存在于植物界中的五羟基黄酮类化合物,具有较高的药用价值。近来大量研究发现,槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、清除氧自由基、抑制破骨细胞吸收以及免疫调节等活性作用。目前槲皮素的研究在肿瘤领域开展较为广泛,而其对软骨细胞影响的报道尚不多见。因此我们想通过本实验,来研究槲皮素在骨性关节炎的病理过程中,是否能够抑制软骨细胞凋亡,影响相应细胞因子表达水平,从而起到治疗骨关节炎的作用。本研究主要分体外实验及体内实验两大部分:一、首先体外培养大鼠软骨细胞,加入白细胞介素-1β(IL-1β)引起细胞凋亡,并在实验组中一同加入不同浓度槲皮素进行干预,检测软骨细胞凋亡率,以及软骨细胞中Bc1-2及Bax、Caspase-9基因表达差异,并进一步分析检测Bcl-2蛋白及Bax蛋白、Caspase-9蛋白和Caspase-3蛋白的表达情况。研究结果显示,当槲皮素达到一定浓度时可以起到抑制IL-1β介导软骨细胞凋亡的作用。通过增加抗凋亡Bcl-2基因及Bcl-2蛋白的表达,抑制促凋亡Bax基因及Bax蛋白、Caspase-9蛋白和Caspase-3蛋白的表达起到保护软骨的作用。二、在关节腔注射木瓜蛋白酶诱导的OA动物模型中,向大鼠灌胃不同浓度的槲皮素悬液,4周后检测膝关节肿胀程度、组织学表现及血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β浓度水平来了解槲皮素对骨关节炎的作用。结果提示一定浓度的槲皮素可减轻关节软骨损伤,缓解关节肿胀,抑制血清中TNF-α和IL-1β炎性因子的表达,从而起到治疗骨关节炎的作用。因此我们得出结论,槲皮素可以对关节软骨起到保护作用,其主要机制为通过调节相关基因及蛋白表达抑制炎症反应和细胞凋亡。第一部分 槲皮素对白介素-1β诱导的大鼠软骨细胞凋亡的保护作用目的:观察槲皮素对软骨细胞凋亡(由白细胞介素-1β(IL-1β)诱导)的影响及相关致病机制的分析。方法:随机法将从正常大鼠关节分离获取的软骨细胞分成5组,分别为对照组(不加任何干预)、IL-1β组(IL-1β 50μg/mL,作用24h)和3个不同浓度的槲皮素组(100μM、200μM、400μM-槲皮素+IL-1β,共同作用24h)。各组软骨细胞均在孔板中孵育,实验重复三次。通过流式细胞仪计算各组细胞的凋亡率,采用PCR和Western blot方法检测Bcl-2、Bax和Caspase-9的相对表达水平,Western blot分析Caspase-3的相对表达水平。结果:与对照组相比,其他4组软骨细胞凋亡率均显著增加,具有统计学意义(P0.05)。PCR得到结果显示促凋亡Bax基因和Caspase-9基因表达均显著升高,而抗凋亡Bcl-2基因表达明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blot分析同样表明Bax蛋白和Caspase-9蛋白表达均显著升高,而Bcl-2蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与IL-1β组相比,高浓度槲皮素组(400μM)软骨细胞凋亡率显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。PCR结果显示促凋亡Bax基因和Caspase-9基因表达均显著降低,而抗凋亡Bcl-2基因表达明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot分析结果表明Bcl-2蛋白表达明显增高,而Bax蛋白和Caspase-9蛋白及Caspase-3裂解蛋白表达均显著降低(P0.05)。结论:槲皮素能降低Bax的表达,增加Bcl-2的表达,同时降低Caspase-9及Caspase-3的表达,从而起到抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡的作用。第二部分 槲皮素对大鼠骨关节炎模型的治疗作用目的:关节腔注射法建立大鼠OA动物模型后,灌胃饲养后观察指标以探讨不同浓度槲皮素对骨关节炎的保护作用。方法:48只的雄性SD大鼠随机均分为空白组(正常、不做干预)、模型对照组、阿司匹林阳性对照组、低剂量槲皮素组、中剂量槲皮素组和高剂量槲皮素组。除外空白组的8只大鼠,其余40只大鼠进行向右膝关节注射木瓜蛋白制作OA模型。建模4周后,造模组每日灌胃以不同的药物溶液各4mL。分别为:模型对照组:0.9%生理盐水灌胃4mL/日;阿司匹林阳性对照组:浓度为5mg/mL的阿司匹林溶液灌胃4mL/日;低剂量槲皮素组:浓度为2.5mg/mL的槲皮素悬液灌胃4mL/日;中剂量槲皮素组:浓度为5mg/mL的榭皮素悬液灌胃4mL/日;高剂量槲皮素组:浓度为10mg/mL的槲皮素悬液灌胃4mL/日。持续4周。末次灌胃后第2日测量大鼠右膝关节直径、取膝关节组织进行组织学制片、ELISA法检测血清炎性细胞因子TNF-α及IL-1β水平。结果:与空白组对比,模型组及3组槲皮素组的大鼠右膝关节直径均显著增大,有显著性差异(P0.05);模型组及中、低浓度槲皮素组血清中TNF-α及IL-1β显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与模型组比较,高剂量槲皮素组和阿司匹林阳性对照组的大鼠膝关节直径显著减小,且具有更低的组织学评分,具有显著性差异(P0.05);通过ELISA法,高剂量槲皮素组和阿司匹林阳性对照组血清中TNF-α及IL-1β水平较模型组明显下降,中剂量槲皮素组血清中IL-1β水平也较模型组明显降低,均具有显著性差异(P0.05)。结论:槲皮素能通过降低炎症因子的表达,在OA动物模型实验中起到对保护关节软骨的作用。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

浙江大学博士学位论文逦正文第一部分实验结果逡逑１．４实验结果逡逑１．４．１大鼠软骨细胞培养结果观测逡逑大鼠膝关节软骨姐织经消化分离原代细胞，培育１０－１４天后形成８０－９０％的细逡逑胞融合。分别使用Ａｌｃｉａｎ邋ｂｌｕｅ染色和ＩＩ型胶原染色进行观察和确定。（图１－１）逡逑

４００｜ａＭ浓度的槲皮素处理后的大鼠软骨细胞凋亡率较其明显下降，且逡逑两者差异有统计学意义（ｐ＜0．0５）；而ｌＯＯｐＭ和２００ｐＭ浓度的槲皮素处理后的软骨逡逑细胞凋亡率虽均低于ＩＬ－ｉｐ组，但差异无统计学意义（ｐ＞０．０邋５）。（图１－３）逡逑２０逡逑

通过ＴＵＮＥＬ染色法在荧光显微镜下观测软骨细胞的凋亡情况，可以更直观逡逑的进一步验证表明：与对照俎相比，ＩＬ－ｌｐ可以明显增加软骨细胞凋亡，而槲皮逡逑素可以有效的减少丨Ｌ－ｉｐ诱导的软骨细胞凋亡。（图１－４）逡逑ｑｉＫＴｃｖｔｉｉＵｊｉＭ）逡逑Ｃｃｔｔｉｒｏｌ逦ＩＵＩ｜ｌ逦１００逦２００逦１００逡逑■■■■■逡逑■■■ＨＵＢ逡逑图１－４邋ＴＵＮＥＬ染色法检测软骨细胞凋亡结果逡逑１．４．３邋槲皮素降低邋Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ邋９邋ｍＲＮＡ邋表徸，增加邋Ｂｃｌ－２邋ｍＲＮＡ逡逑表达逡逑ＰＣＲ结果揭示了调亡基因Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ９ｍＲＮＡ以及抗调亡基因Ｂｃｌ－２逡逑ｍＲＮＡ表达水平，我们通过以（３－ａｃｔｉｎ为内参照，将（３－ａｃｔｉｎ基因的相对表达率设逡逑２１逡逑

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本文编号：2822764