基于液质联用技术的中药黄酮类成分的体内外代谢研究以及鸭跖草化学成分的定性定量分析

发布时间：2020-09-27 19:50

　　药物进入体内后在代谢酶的作用下发生结构性的改变,产生毒性或活性代谢物。其中肝脏是药物产生代谢物的主要器官,肝微粒体温孵模型是最常用的体外代谢体系。药物的体内代谢研究较全面地阐明药物的代谢途径,为临床药物治疗和毒副作用监测奠定了基础。中药鸭跖草化学成分复杂,主要用于风热感冒、高烧不退、咽喉肿痛、水肿尿少、热淋涩痛和痈肿疔毒。但是《中国药典》2015年(一部)未收载鸭跖草的含量测定。因此,本研究旨在建立高效液相色谱-质谱联用方法分析中药大蓟中主要黄酮化合物在大鼠体内的代谢途径;鉴别漆黄素、槐角苷和甘草苷单体成分分别在大鼠体内外的代谢产物;识别鸭跖草化学成分及其多组分含量测定。第一部分中药大蓟中主要黄酮类成分的体内代谢研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法分析中药材大蓟提取物中主要黄酮类成分在大鼠体内的代谢途径。方法:大鼠灌胃给予大蓟提取物后,收集血浆、尿液和胆汁生物样品,采用液-液萃取方法进行样品前处理。首先采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,ESI源正离子模式监测,全扫描结合多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS),在线采集数据,采用多种数据处理方法筛选主要黄酮类化合物(柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素)可能的代谢物。根据代谢物的精确分子质量、元素组成、二级质谱图、相关的生物转化规律和母药化合物的裂解规律,推断中药大蓟提取物的可能代谢物。同时,引进Clog P值重要参数,以区分同分异构体。色谱柱Poroshell 120 EC-C_(18)(2.1×100mm,2.7μm),配有SecurityGuard~?UHPLC C_(18)预柱(Poroshell);流动相为水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为5μL。结果:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术识别了12种吸收组分,共鉴定了25种代谢物。实验发现水解反应是柳穿鱼叶苷和蒙花苷代谢的第一步,然后氧化和还原反应发生,但是未检测到柳穿鱼叶苷和蒙花苷的结合代谢物。实验总结了柳穿鱼黄素代谢途径,主要包括氧化、还原、水解、葡萄糖醛酸化和葡萄糖结合反应。结论:本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析大蓟提取物中主要黄酮类化合物的代谢物,为大蓟进一步的药理学和药物活性研究奠定了基础。本方法简便、快速,适用于中药材的体内代谢产物的分析。第二部分漆黄素的体内外代谢研究目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析漆黄素单体成分在大鼠体内外的代谢产物。方法:建立I相温孵体系:1.0 mg/mL肝微粒、3.3 mmol/L MgCl_2、1.3 mmol/Lβ-NADPH和100μmol/L漆黄素对照品溶液(甲醇占总体积的1%);建立II相温孵体系:1.0 mg/mL鼠肝微粒体、2 mmol/L UDPGA、8 mmol/L MgCl_2、25μg/mL丙甲菌素和100μmol/L漆黄素对照品溶液(甲醇占总体积的1%)。大鼠灌胃给予漆黄素混悬液后,分别收集血浆、尿液、胆汁和粪便生物样品,体外I相代谢样品预处理采用液-液萃取方法,而体外II相体系和体内生物样品采用甲醇沉淀蛋白的方法进行样品前处理。结果:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法共鉴定了漆黄素在大鼠肝微粒中14种代谢物,体内53种代谢物(11种I相代谢物和42种II相代谢物),其中,血中18种、尿液49种、胆汁34种和粪便34种代谢物。漆黄素的主要代谢途径为氧化、还原、葡萄糖醛酸化和硫酸盐结合反应。实验发现氧化和丢失氧原子反应是发生甲基化、氢化、硫酸化和葡萄糖醛酸化反应的基础反应。结论:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法鉴定漆黄素在大鼠体内外的代谢物,结果显示UHPLC-Q-TOF-MS/MS是识别药物代谢物的强有力的工具,将会引导理解药物的生物转化,为药物的临床应用和药理研究奠定理论基础。第三部分槐角苷的体内外代谢研究目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析槐角苷单体成分在大鼠体内外的代谢产物及其代谢途径。方法:分别建立I相和II相温孵体系,大鼠灌胃给予槐角苷混悬液后,分别收集血浆、尿液、胆汁和粪便生物样品。体外I相样品采用液-液萃取方法进行前处理,体外II相和体内的生物样品前处理均采用甲醇沉淀蛋白的方法。色谱柱Poroshell 120 EC-C_(18)(2.1×100 mm,2.7μm),配有SecurityGuard~?UHPLC C_(18)预柱(Poroshell);流动相:水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为3μL。结果:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,基于在线数据采集和数据加载策略,在大鼠体内共鉴定了60种代谢物(I相代谢物22种和II相代谢物38种),其中在大鼠血浆中检测到10种代谢物,在尿液中发现了46种代谢物,在大鼠胆汁中识别了35种代谢物,在大鼠粪便中识别了25种代谢物。此外,在大鼠肝微粒体体系中发现4种代谢物(2种I相和2种II相代谢物)。槐角苷主要经历了结合反应,包括甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化、谷胱甘肽结合、甘氨酸结合和乙酰化。而且在血浆、尿液、胆汁和粪便生物样品中也检测到了氧化、还原和水解代谢物,但是在体外温孵体系中仅仅发现了氧化和水解I相代谢物。结论:本研究建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法,结合多种数据加载技术识别槐角苷的体内外代谢产物,本研究将会更好的理解槐角苷的生物转化和代谢机制,将会为其进一步的药理学和毒理学研究奠定基础。第四部分甘草苷的体内外代谢研究目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对甘草苷单体成分的体内外代谢产物进行研究。方法:分别建立I相和II相温孵体系,大鼠灌胃给予甘草苷混悬液后,分别收集血浆、尿液、胆汁和粪便生物样品。体外I相、II相和体内生物样品分别采用液-液萃取、甲醇沉淀蛋白和甲醇沉淀蛋白的方法进行样品前处理。采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术在线采集数据,利用MetabolitePilot 1.5和PeakView 1.2数据加载软件得到代谢物的精确质量数、二级质谱以及母药甘草苷的裂解规律,推断可能的代谢物。色谱柱Poroshell 120 EC-C_(18)(2.1×100 mm,2.7μm),配有SecurityGuard~?UHPLC C_(18)预柱(Poroshell);流动相:水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为3μL。结果:采用UHPLC-Q-TOF-MSMS技术在大鼠体内共鉴定了56种代谢物(27种I相代谢物和29种II相代谢物),分别在大鼠血浆、尿液、胆汁和粪便识别了20、54、48和37种代谢物。此外,在大鼠肝微粒温孵体系中共鉴定了15种代谢物(11种I相代谢物和4种II相代谢物)。甘草苷的主要代谢途径为氧化、还原、水解、甲基化、乙酰化、硫酸化和葡萄糖醛酸化反应。结论:应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析甘草苷的体内外代谢物。实验结果为活性代谢物的筛选奠定基础,而且本研究展现了强有力的分析策略快速地筛选和识别传统中药的化学成分及其代谢物。第五部分鸭跖草中化学成分的定性定量研究目的:建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS法分析鉴定中药鸭跖草的化学成分,同时,建立HPLC-MS/MS法同时测定鸭跖草中荭草素、异荭草素、牡荆素、异牡荆素、芦丁、芹菜素、原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、槲皮素和异鼠李素13种化学成分的含量。方法:定性采用Poroshell 120 SB-C_(18)色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7μm),柱温25°C,以水(0.1%的甲酸)-甲醇为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.3 mL/min,进样量1μL,采用正负离子模式同时监测。定量采用Wonda Cract ODS-2 C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱温25°C,以水(0.1%的甲酸-2 mmol/L甲酸铵)-甲醇为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.8 mL/min,进样量10μL,采用电喷雾离子源进行负离子模式监测,多反应监测模式(MRM),源喷射电压为-4 500 V,离子源温度为650°C。结果:本研究共检测到62种化学成分,其中22种化学成分已与相应对照品的保留时间和二级质谱进行比对,确认其化学结构,40种化学成分根据二级质谱进行推断。测定的13种化学成分的峰面积和浓度在测定范围内均呈现良好的线性关系(r≥0.9991),加样回收率为98.64%~100.8%,日内和日间精密度RSD值分别小于1.04%和0.92%。结论:本法简便快速、灵敏度高、专属性好,可用于鸭跖草中13种化学成分的含量测定,为鸭跖草进一步的药代动力学、药理学和毒理学研究奠定了基础。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285;R284.1
【部分图文】：

柳穿鱼,蒙花苷,黄素,质谱图

图 3 柳穿鱼叶苷（A）、蒙花苷（B）和柳穿鱼黄素（C）的质谱图及其裂解途径Fig. 3 The MS/MS spectra and predominant fragmentation patterns ofpectolinarin (A), linarin (B) and pectolinarigenin (C)

尿液,胆汁,样品,流图

26图 4 大鼠体内代谢物的提取流图（A1-2 血浆样品、B1-5 尿液样品、C1-2胆汁样品）Fig. 4 Extracted ion chromatograms of all metabolites in rat (A1-2 in rat bloodsample, B1-5 in rat urine sample, C1-2 in rat bile sample)

质谱图,代谢产物

代谢产物的质谱图

【参考文献】