基于化学表征—数据挖掘的三七和相关制剂的质量控制研究
发布时间：2020-09-27 21:16
中药复杂体系的化学表征有助于阐明其药效物质基础、完善其质量控制体系,从而推进中药的标准化和国际化。但中药成分类型多样、结构复杂、含量差异大,如何高效、灵敏地靶向表征中药的活性成分,是中药化学表征中亟待解决的关键问题。本论文以三七及相关制剂为研究对象,基于超高效液相色谱-高分辨质谱分析平台,结合智能自动化分析软件,从色谱分离-数据挖掘两个方面,开展化学表征新方法研究。提出了“离线二维分离-扩展数据库匹配”的策略,用于三七总皂苷制剂及三七叶中皂苷成分的靶向表征,并根据三七总皂苷制剂表征结果进行不同厂家的三七总皂苷制剂的比较,根据三七叶成分表征结果进行新颖皂苷成分的靶向分离。1.结合正交的HILIC和反相色谱分离机制,构建了离线全二维液相(2D LC)分离系统。该系统的理论峰容量和正交性分别为8976和0.84。通过串联QTOF高分辨质谱,采用碎片特征性强的fast DDA扫描模式,从血栓通注射剂中共鉴定了148个皂苷成分。该研究为微量、痕量皂苷成分的暴露和分离提供了方法参考,同时阐明了血栓通注射剂的化学物质基础,为其质量控制研究提供了依据。2.基于前述三七皂苷成分的研究,采用非靶向植物代谢组学方法,对多厂家的130批血栓通制剂与血塞通制剂进行系统的分析。结果表明血栓通与血塞通之间以及不同剂型之间化学成分均无明显差别;梧州制药产血栓通与其他厂家的血栓通、血塞通成分差异明显,结合三七总皂苷定性分析结果,通过OPLS-DA共鉴定差异成分20个,其中Rd周围原人参二醇型皂苷成分在梧州制药产血栓通中的含量明显低于其他厂家。另外,采用相同方法对三七不同部位进行分析,共鉴定三七主根与三七剪口的差异成分15个。差异成分关联分析表明,制剂成分差异与三七投药部位无关。该研究为三七总皂苷制剂质量控制体系的构建奠定了基础。3.基于已构建的离线二维系统,提出了“离线二维分离-扩展数据库匹配”的研究策略,对三七叶皂苷成分进行系统表征。基于UNIFI智能软件平台,通过数据库匹配对2D LC QTOF MS采集的数据进行解析。针对数据库匹配受限于化合物数目的问题,我们提出了代谢物预测法进行数据库扩展。以丙二酰基、葡萄糖、鼠李糖和木糖作为修饰基团,经过两步结构修饰,将三七数据库中的化合物数目扩大14倍,化合物匹配数目为原数据库匹配的2.56倍。最终从三七叶中共鉴定了945个皂苷成分,其中662个为人参属潜在的新化合物。以上基于UNIFI软件的扩展数据库匹配方法大大简化了鉴定流程,与离线二维方法结合使用,实现了中药单味药材中化合物鉴定数目的突破。同时,该研究为人参属新颖皂苷结构的发现奠定了基础。4.开展了LC-MS导向的三七叶化学分离研究,对以上潜在新颖皂苷成分进行结构确证。综合运用多种色谱及波谱技术,最终从三七叶中分离并鉴定了19个新化合物,包括3个降三萜皂苷(notoginsenosides L1-L3)、1个3-OH乙酰化皂苷(notoginsenoside L4)、8个3-OH丙二酰化皂苷(notoginsenosides L5-L12)及7个C-17侧链杂化型皂苷(notoginsenosides L13-L19)。其中,8个3-OH丙二酰化皂苷在三七叶和三七花中含量较高,而在三七根中含量较低,可以作为潜在的质量标志物用于区分三七地上部分和地下部分。综上,本论文建立了三七皂苷成分的靶向表征方法,系统分析了三七及其相关制剂的化学成分,同时不同厂家制剂的成分进行比较,并对三七叶中潜在新颖成分进行分离,为三七及其相关制剂质量控制研究奠定了基础,同时为中药复杂体系的化学物质基础研究提供了新的策略和方法。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284
【部分图文】：
第 2 章 离线 2D LC-MS 用于血栓通注射剂的系统表征Sartorius CP224S 电子天平 (SartoriusInc., Germany)；Elmasonic P 180H 超声波清洗仪 (Elma, Germany)；L530 离心机 (湖南长沙湘仪检测设备有限公司)。Agilent 1100 液相系统，配有 VWD 检测器、四元泵、柱温箱、自动进样器及在线脱气机，采用 Agilent ChemStation A 10.02 色谱工作站。Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相系统，配有 PDA 检测器、二元泵、柱温箱、自动进样器及脱气机，串接 Xevo G2-S QTOF 质谱仪。配有 Masslynx4.1 工作站。
2.2.1.1 色谱柱筛选以三七药材样品 (34#主根)进行色谱柱的筛选。采用的色谱条件如下：乙腈(A)-2 mM AA (B)为流动相，30°C 柱温，0.3 mL/min，使用梯度洗脱：0-3 min,18%-24% (A); 3-6.5 min, 24%-25% (A); 6.5-7 min, 25%-33% (A); 7-13 min, 33%(A); 13-16 min, 33%-55% (A); 16-17 min, 55%-95% (A); 17-21 min, 95% (A)。反相色谱已经被广泛用于人参类药材的分析中，具有较好的选择性8, 34,35。因此，本实验中首先考察 6 款 RP C18 对三七皂苷分离的选择性，作为第二维色谱柱:Waters的HSST3,BEHC18, CSHC18;Agilent SBC18,SB-Aq及PhenomenexKinetexXB-C18 (图 2.2)。结果显示，HSST3 与 CSHC18 对于皂苷成分表现出较强的保留能力，特别是对于大极性皂苷 (BPC 中 noto-R1 之前的成分群)。进一步比较，HSS T3 柱在中等极性区域 (BPC 图中 Rg1 与 Rb1 之间)能够分离出的色谱峰更多。根据柱效和保留能力，最终选用 HSS T3 作为第二维色谱柱。
基于化学表征-数据挖掘的三七和相关制剂的质量控制研究对于第一维的 HILIC 分离，我们对流动相和柱温进行考察，以期获得最佳谱分离条件。考察的流动相包括乙腈-水，乙腈-0.1%FA 及乙腈-2mMAA(图 2.7)。结果，当水相中加入 0.1% FA 或 2mM AA 时，三七皂苷在 HILIC 色谱柱上的保为没有明显的影响。为了使流份便于制备分析，最终采用乙腈-水作为流动相考察柱温对于三七皂苷在 HILIC色谱柱上保留行为的影响，包括 25°C, 305°C 以及 40°C (图 2.8)。结果显示，当柱温在 25°C-40°C 内升高时，三七皂 HILIC 柱上的保留能力减弱。相对地，当柱温设置为 25°C，色谱图中间的以与 noto-R1 及 Rd 实现分离。因此，最终选择 25°C 的柱温。
本文编号：2828381
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284
【部分图文】：
第 2 章 离线 2D LC-MS 用于血栓通注射剂的系统表征Sartorius CP224S 电子天平 (SartoriusInc., Germany)；Elmasonic P 180H 超声波清洗仪 (Elma, Germany)；L530 离心机 (湖南长沙湘仪检测设备有限公司)。Agilent 1100 液相系统，配有 VWD 检测器、四元泵、柱温箱、自动进样器及在线脱气机，采用 Agilent ChemStation A 10.02 色谱工作站。Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相系统，配有 PDA 检测器、二元泵、柱温箱、自动进样器及脱气机，串接 Xevo G2-S QTOF 质谱仪。配有 Masslynx4.1 工作站。
2.2.1.1 色谱柱筛选以三七药材样品 (34#主根)进行色谱柱的筛选。采用的色谱条件如下：乙腈(A)-2 mM AA (B)为流动相，30°C 柱温，0.3 mL/min，使用梯度洗脱：0-3 min,18%-24% (A); 3-6.5 min, 24%-25% (A); 6.5-7 min, 25%-33% (A); 7-13 min, 33%(A); 13-16 min, 33%-55% (A); 16-17 min, 55%-95% (A); 17-21 min, 95% (A)。反相色谱已经被广泛用于人参类药材的分析中，具有较好的选择性8, 34,35。因此，本实验中首先考察 6 款 RP C18 对三七皂苷分离的选择性，作为第二维色谱柱:Waters的HSST3,BEHC18, CSHC18;Agilent SBC18,SB-Aq及PhenomenexKinetexXB-C18 (图 2.2)。结果显示，HSST3 与 CSHC18 对于皂苷成分表现出较强的保留能力，特别是对于大极性皂苷 (BPC 中 noto-R1 之前的成分群)。进一步比较，HSS T3 柱在中等极性区域 (BPC 图中 Rg1 与 Rb1 之间)能够分离出的色谱峰更多。根据柱效和保留能力，最终选用 HSS T3 作为第二维色谱柱。
基于化学表征-数据挖掘的三七和相关制剂的质量控制研究对于第一维的 HILIC 分离，我们对流动相和柱温进行考察，以期获得最佳谱分离条件。考察的流动相包括乙腈-水，乙腈-0.1%FA 及乙腈-2mMAA(图 2.7)。结果，当水相中加入 0.1% FA 或 2mM AA 时，三七皂苷在 HILIC 色谱柱上的保为没有明显的影响。为了使流份便于制备分析，最终采用乙腈-水作为流动相考察柱温对于三七皂苷在 HILIC色谱柱上保留行为的影响，包括 25°C, 305°C 以及 40°C (图 2.8)。结果显示，当柱温在 25°C-40°C 内升高时，三七皂 HILIC 柱上的保留能力减弱。相对地，当柱温设置为 25°C，色谱图中间的以与 noto-R1 及 Rd 实现分离。因此，最终选择 25°C 的柱温。
本文编号：2828381
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