蛹虫草富硒条件培养优化及硒多糖活性机理的研究

发布时间：2020-09-29 11:34

　　 蛹虫草[Cordyceps militaris(Vuill.)Fr.]既是我国传统名贵中药材,也是重要的林下食用菌资源,具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节免疫等诸多药理作用。硒是人体必需的微量元素,缺硒会导致人体发生多种疾病,而硒缺乏在世界各地普遍流行。由于有机硒易于被动物吸收,具有较高生物利用率及毒性阈值等优点,已经得到了人们广泛关注。蛹虫草具有良好的富硒能力,是珍贵的富硒食药用菌,硒多糖兼具硒和多糖的生物活性,可作为理想的硒膳食补充剂进行研发。为此,本论文以蛹虫草为研究对象,通过添加无机硒对富硒蛹虫草培养基配方及栽培条件进行优化,以获得蛹虫草富硒栽培技术。在此基础上,研究了富硒蛹虫草子座及蛋白质中硒的分布规律,对硒多糖提取工艺进行优化,并研究了硒多糖分离纯化和结构表征,同时对硒多糖抗氧化活性及体内免疫调节活性进行了研究,为富硒蛹虫草的开发利用提供了理论依据,主要研究结果如下:(1)以富硒蛹虫草产量和硒含量为指标,采用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计方法,对影响栽培效果的9个因素进行筛选,对关键因素进行优化,得到富硒蛹虫草最佳栽培培养基配方:葡萄糖20 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、硫酸镁1.5 g/L、柠檬酸三铵1 g/L、维生素B1 50 mg/L、亚硒酸钠添加量240 mg/L、小麦600 g/L;最佳培养条件:常温浸泡26 h,发菌培养温度18℃,原基诱发温度16℃,子座生长温度22℃;在此条件下,富硒蛹虫草产量为175.57 g/kg,子座硒含量为197.32μg/g。与普通蛹虫草栽培相比,其产量、多糖及虫草素含量分别提高了 9.04%、24.06%、69.42%。硒含量提高了 52.86 倍。(2)依据富硒蛹虫草的生长曲线,对富硒蛹虫草子座和蛋白质中硒的分布规律进行了研究,研究结果表明:蛹虫草子座硒产量、硒含量、蛋白硒含量、蛋白硒占总硒比均随着硒添加量的增加而增加,但蛋白硒占总硒比各处理组间差异不显著(p0.05);相同硒添加量条件下,不同时期子座硒产量随蛹虫草的生长而增加,子座硒含量先下降后上升,在成熟期蛹虫草子座硒含量显著提高,蛋白硒含量和蛋白硒占总硒比呈下降趋势(p0.05);富硒可显著提高蛹虫草碱溶性蛋白含量(p0.05),而高硒添加量(120 mg/kg)可显著降低水溶性、盐溶性及醇溶性蛋白在子座中含量(p0.05),且随着蛹虫草的生长4种蛋白组分含量逐渐降低;硒在4种蛋白组分中分布呈不均衡性,硒含量顺序为碱溶性蛋白水溶性蛋白盐溶性蛋白醇溶性蛋白,但水溶性蛋白对硒具有更大的承载能力;富硒蛹虫草不同分子量蛋白与硒结合量具明显的负相关。(3)采用Box-Behnken试验设计和响应面分析法,应用水提法、微波提取法及超声波-微波联合提取技术对富硒蛹虫草硒多糖提取进行优化,得富硒蛹虫草硒多糖超声波-微波联合提取最佳工艺:超声时间26.0 min、微波时间3.2 min、微波功率350 W、液料比32 mL/g,在此条件下,硒多糖提取率达5.05%。超声波-微波联合提取法具有提取时间短,提取率高,硒多糖抗氧化活性强等优点,是硒多糖提取最优方法。(4)利用DEAE-52和Sephacryl S-400层析柱纯化得3对普通多糖及硒多糖,分别为 Se-/CMP-Ⅰ、Se-/CMP-Ⅱ、Se-/CMP-Ⅲ,且 Se-/CMP-Ⅲ 在子座中含量最高;HPSEC分析结果表明,除Se-/CMP-Ⅰ外,Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ为多糖均一级分,平均分子量基本一致;硒及糖醛酸含量测定结果表明,三个硒多糖级分硒含量依次为Se-CMP-ⅢSe-CMP-ⅡSe-CMP-Ⅰ,硒在高分子量级分中分布较多,且Se-/CMP-Ⅰ和Se-/CMP-Ⅱ及Se-/CMP-Ⅲ糖醛酸含量不存在显著差异(p0.05);单糖组成富硒表明,Se-/CMP-Ⅱ主要由甘露糖、半乳糖及葡萄糖组成,Se-/CMP-Ⅲ为葡萄糖组成的均质多糖,且CMP-Ⅱ与Se-CMP-Ⅱ单糖摩尔比一致;红外光谱、1HNMR及13CNMR分析结果表明,富硒未改变Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ主体结构,Se-CMP-Ⅱ中硒可能通过0-6取代连接到碳骨架中,且取代发生位点主要发生于其支链的末端β-D-Glcf-(1→残基上,并以硒酸酯形式存在,在Se-CMP-Ⅲ结构中除0-6取代外,硒还可能是以取代→6)-α-D-Glcp-(1 →的C-6或→4)-α-D-Glcp-(1→残基的C-2上的-OH形成的结构形式存在。(5)为研究硒多糖构效关系,对Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ体外抗氧化活性进行了研究。研究结果表明:富硒蛹虫草与普通蛹虫草相比,Se-CMP-Ⅱ和Se-CMP-Ⅲ总还原力、·OH自由基及ABTS+自由基清除率均显著高于CMP-Ⅱ和CMP-Ⅲ(p0.01);Se-CMP-Ⅱ较CMP-Ⅱ对O 2-自由基清除率差异不显著(p0.05),但Se-CMP-Ⅲ较CMP-Ⅲ对O 2-自由基清除率差异显著(p0.01)。(6)在D-半乳糖诱导下构建亚急性衰老动物模型,对Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ体内抗氧化活性进行对比分析,研究结果表明:随着Se-CMP-Ⅲ剂量的增加,小白鼠体重、T-AOC、T-SOD、GSH-Px及CAT活性随之增加(p0.05),而肝、肾、心及血清中的MDA含量降低(p0.05),且Se-CMP-Ⅲ活性优于CMP-Ⅲ,从而说明含硒基团的引入可显著提升CMP-Ⅲ的抗氧化活性,富硒蛹虫草Se-CMP-Ⅲ是一种潜在的抗氧化和抗衰老功能食品资源。(7)利用环磷酰胺构建小白鼠免疫抑制模型,对Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ免疫调节活性进行评价,研究结果表明:Se-CMP-Ⅲ对环磷酰胺诱导的小白鼠免疫机能下降具有明显的缓解作用,可显著提高小白鼠体重、脾脏及胸腺指数、外周血白细胞数、血清Ig G、Ig A、IgM含量、巨噬细胞吞噬指数、脾淋巴细胞增殖能力(p0.05),同时可显著提高脾、外周血淋巴细胞CD4+/CD8+值,并可改善环磷酰胺造成的肝损伤。采用ELISA法对血清TNF-α IL-6、IL-2及IFN-γ含量进行测定,表明Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ能够显著提升血清中4个细胞因子水平(p0.05)。在相同剂量下,与CMP-Ⅲ相比,Se-CMP-Ⅲ具有更高的免疫调节活性,说明含硒基团是Se-CMP-Ⅲ发挥免疫调节活性的重要结构元件之一,Se-CMP-Ⅲ可作为一种新型的免疫调节剂资源进行研发。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S567.3;R284
【部分图文】：

图３－２富硒蛹虫草子卖体中有机硒分布逡逑Ｆｉｇ３－２邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｒｇａｎｉｃ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｉｎ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ．邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑由图３－２可知：硒大部分存在于可溶性蛋白分子中，占总硒含量的５５．８９％，其次分布逡逑于多糖中的硒，为１７．８３％，以核酸中分布的硒最少，其仅占样品总硒含量的０．２８％。由此逡逑可见，富硒蛹虫草中蛋白和多糖结合硒是硒在富硒蛹虫草中的主要赋存形式。逡逑３．３．２．２子座硒含量变化逡逑３0０１逦Ｔ逡逑Ｉ—Ｓ；逡逑％逦卜￣Ｓ＊逡逑０－＾—逦逦逦逦逦逦逦逦．逦逦逦ｒ逡逑０逦６０逦１２０逦１８０逦２４０逡逑亚硒酸钠添加量（ｍｇ／ｋｇ）逡逑图３－３不同亚硒酸钠添加量对富硒蛹虫草砸含量的影响逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｅｌｅｎｉｔｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｎ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑由图３－３可知：在硒添加量３０？２４０邋ｍｇ／ｋｇ范围内，随着亚硒酸钠添加量的增加，子座逡逑－３６－逡逑

ｓ邋ｉｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｆｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ邋ａｓ邋ａ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅ富硒蛹虫草成熟期（Ｓ４）四种蛋白含量的影响如图３，随着硒添加量的提高四种蛋白在富砸蛹虫草中的含蛹虫草碱溶性蛋白的含量，２４０邋ｍｇ／ｋｇ处理组其含量．１４％。方差分析结果表明，各处理组中，除１２０邋ｍｇ／ｋｇｋｇ处理组差异不显著外（；？＞０．０５），其余各组间间在亚砸酸钠添加量＜６０邋ｍｇ／ｇ时，虫草子座中水溶性、（户＞0．0５），可在１２０邋ｍｇ／ｋｇ和２４０邋ｍｇ／ｋｇ处理组中，以。逡逑１２０１逦■■水溶性２品逡逑＿盐溶性蛋白Ｉ逡逑］00＿逦ａ逦ＪｌW醇？性蛋白；逡逑Ｔ逦ｂ逦丨 ■磁溶性银白ｊ逡逑

图３－９富硒蛹虫草各蛋白组分中硒含量逡逑Ｆｉｇ３－９邋Ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｆｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ．邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑由图３－９可知：与各组分蛋白含量趋势相同，各组分硒含量差异较大（；？＜０．０１），其逡逑中，碱溶性蛋白硒含量最高达５３．７０邋｜Ｌｉｇ／ｇＤＷ，占总蛋白硒的５９．７８％，其次为水溶性蛋白，逡逑其硒含量２６．９６邋呢／ｇＤＷ，盐溶性蛋白和醇溶性蛋白硒含量较低，二者占蛋白总硒比均不足逡逑１０％。这表明碱溶性和水溶性蛋白是蛹虫草蛋白与硒结合的主要组分。这与前人研宄巴西果逡逑［２８３］、小麦［２７８］及双歧杆菌＿富硒的结果相一致。此外，结合以上蛋白含量测定结果可知，逡逑水溶性蛋白仅占总可溶蛋白含量的２０．９３％，而硒含量却占蛋白总硒含量的３０．０１％，这表明逡逑相对于其他蛋白组分，蛹虫草水溶性蛋白对硒具有更大的承载能力。逡逑３．３．４硒在蛹虫草不同分子置蛋白中的分布逡逑ＫＤａ邋Ｍａｒｋｅｒ邋Ｂａｎｄｓ邋Ｇｒｏｌ，Ｐｓ逡逑ｉ２（）逡逑ｊ00邋—逡逑｜灥彐ｎ＞逡逑Ｌ逡逑２０VW－ｖ逡逑桯ＶＩ逡逑图３－１０富硒蛹虫草总蛋白ＳＤＳ＾ＰＡＧＥ图谱逡逑Ｆｉｇ３－１０邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ．邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对富砸蛹虫草总蛋白进行分离

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本文编号：2829668