何首乌饮及其单体化合物对大鼠Leydig细胞衰老关键基因甲基化调控机制研究

发布时间：2020-10-01 05:44

　　目的:探讨何首乌饮及其单体化合物对大鼠睾丸间质细胞衰老关键基因甲基化调控机制研究方法:1.差异贴壁法分离、培养睾丸间质细胞(Leydig cell,LC),采用3β-HSD细胞化学染色进行鉴定,结果显示Leydig细胞的纯度可达90%以上。2.采用自由基氧化损伤方法建立Leydig细胞衰老模型,检测β-半乳糖苷酶的表达水平,判断衰老模型是否成功。根据H_2O_2和FeSO_4不同的用量和作用时间,β-半乳糖苷酶的阳性表达水平,确定建立细胞衰老模型的最适条件。3.依据实验目的分为正常组、衰老组、何首乌饮组、淫羊藿苷组、松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组。并采用MTT法筛选淫羊藿苷、松果菊苷、齐墩果酸和二苯乙烯苷作用于Leydig细胞的最适浓度。4.运用实时荧光定量PCR技术检测各组表观遗传关键基因Ttc29、AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb的mRNA表达水平。5.运用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测各组表观遗传关键基因Ttc29、AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb的甲基化水平。6.采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术检测各组表观遗传基因Ttc29、AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb启动子区域H3K27me3、H3K9me3和H3K9me2的富集。7.采用双因素和单因素方差分析法对MTT结果统计分析,相关性分析采用Person法,其余均采用单因素方差分析。结果:1.根据不同条件下β-半乳糖苷酶的阳性表达水平,最终确定细胞衰老模型的条件为:H_2O_2和FeSO_4的终浓度分别为50μmoL·L~(-1)和100μmoL·L~(-1),体积各为2μL,作用时间为8 h。2.MTT法确定药物作用于Leydig细胞作用72 h的浓度为:淫羊藿苷40μM,松果菊苷20μM,齐墩果酸20μM,二苯乙烯苷50μM。3.何首乌饮及其单体化合物对Ttc29的甲基化调控作用3.1 mRNA表达水平:与正常组比较,衰老组表达水平明显升高(P0.05);何首乌饮组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组表达水平明显低于衰老组(P0.05),淫羊藿苷组和松果菊苷组与衰老组无显著性差异(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。3.2甲基化水平:与正常组比较,衰老组甲基化水平明显升高(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组、松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组的甲基化百分比明显低于衰老组(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。3.3组蛋白甲基化:Ttc29启动子区域未检测到H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2的富集。4.何首乌饮及其单体化合物对AXL的甲基化调控作用4.1 mRNA表达水平:与正常组比较,衰老组表达水平明显升高(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组和松果菊苷组表达水平明显低于衰老组(P0.05);齐墩果酸与衰老组无显著性差异(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。4.2甲基化水平:与正常组比较,衰老组甲基化水平明显降低(P0.05);何首乌饮组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组的甲基化百分比显著高于衰老组(P0.05);淫羊藿苷组、松果菊苷组与衰老组无显著性差异(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。4.3组蛋白甲基化:AXL启动子区域H3K27me3富集极低,几乎检测不到H3K9me3和H3K9me2。5.何首乌饮及其单体化合物对wnt2b的甲基化调控作用5.1 mRNA表达水平:与正常组比较,衰老组表达水平明显升高(P0.05);何首乌饮组和二苯乙烯苷组表达水平明显低于衰老组(P0.05);淫羊藿苷、松果菊苷和齐墩果酸与衰老组无显著性差异(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。5.2甲基化水平:与正常组比较,衰老组甲基化水平明显降低(P0.05);与衰老组比较,何首乌饮组、淫羊藿苷组、松果菊苷组和二苯乙烯苷组的甲基化百分比明显升高(P0.05);齐墩果酸组与衰老组无显著性差异(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。5.3组蛋白甲基化:与正常组相比较,衰老组wnt2b启动子区域H3K27me3富集显著降低(P0.05),而H3K9me3和H3K9me2的富集差异没有统计学意义(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组wnt2b启动子区域H3K27me3富集明显高于衰老组(P0.05),而松果菊苷组与衰老组之间无显著性差异(P0.05)。何首乌饮组及各单体化合物组与衰老组比较,H3K9me3和H3K9me2的富集差异无统计学意义(P0.05)。6.何首乌饮及其单体化合物对C-myb的甲基化调控作用6.1 mRNA表达水平:与正常组比较,衰老组表达水平明显降低(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组、松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组表达水平明显高于衰老组(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。6.2甲基化水平:与正常组比较,衰老组甲基化水平明显降低(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组、松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组的甲基化百分比明显高于衰老组(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。6.3组蛋白甲基化:与正常组相比较,衰老组C-myb启动子区域H3K9me3富集明显增加(P0.05),而H3K27me3和H3K9me2富集差异不大(P0.05)。与衰老组比较,何首乌饮组、松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组C-myb启动子区域H3K9me3富集显著降低(P0.05),淫羊藿苷组与衰老组无显著性差异(P0.05)。齐墩果酸组H3K27me3富集明显高于衰老组(P0.05),其余各组与衰老组之间差异不大(P0.05)。何首乌饮及单体化合物组与衰老组比较,H3K9me2富集无显著性差异(P0.05)。7.何首乌饮及其单体化合物对MAPK10的甲基化调控作用7.1 mRNA表达水平:与正常组比较,衰老组表达水平明显升高(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组,松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组表达水平明显低于衰老组(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。7.2甲基化水平:与正常组比较,衰老组甲基化水平明显降低(P0.05);何首乌饮组、淫羊藿苷组,松果菊苷组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组的甲基化百分比明显高于衰老组(P0.05);其中,何首乌饮组效果最好(P0.05)。7.3组蛋白甲基化:MAPK10启动子区域未检测到H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2的富集。8.相关性分析AXL、wnt2b、MAPK10的表达水平和甲基化水平呈高度的负相关(P0.05);C-myb的表达水平和甲基化水平呈高度正相关(P0.05);Ttc29的表达水平和甲基化水平的相关系数没有显著性差异(P0.05)。结论:1.何首乌饮通过下调AXL、wnt2b、MAPK10和Ttc29基因mRNA水平,上调C-myb基因mRNA水平,延缓Leydig细胞衰老,且效果明显优于其他单体化合物组。2.何首乌饮通过上调AXL、wnt2b、MAPK10和C-myb的甲基化水平,下调Ttc29的甲基化水平,延缓Leydig细胞衰老,且效果明显优于其他单体化合物组。3.AXL、wnt2b、MAPK10的甲基化水平和mRNA表达水平呈负相关;C-myb的甲基化水平和mRNA表达水平呈正相关,Ttc29的甲基化水平和mRNA表达水平无相关性。何首乌饮通过调控基因的甲基化水平和mRNA表达水平抑制Leydig细胞衰老。4.何首乌饮通过上调H3K27me3的表达,抑制wnt2b基因转录;同时可能通过下调H3K9me3的表达,促进C-myb基因转录,抑制Leydig细胞衰老过程,且效果明显优于其他单体化合物组。
【学位单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

遗传变化,老化过程,组蛋白,甲基化

老化过程中表观遗传变化的概述

DNA甲基化,老化过程

可以与老化过程中总的及局部的 DNA 低甲基化同时发生，这可能是为了抑制某些特定基因的表达（图2）。有分析表明顺式作用元件的 DNA 甲基化缺失，如胰腺 B 细胞增强子区域，提示转录因子结合可能降低 DNA 甲基转移酶识别这些位点的能力，导致衰老细胞基因异常表达[30]。研究发现哺乳动物某些 CpG 位点的甲基化水平与年龄之间呈现出显著的相关性，可以作为“表观遗传时钟”，用于预测生物学年龄[31]。SIRT 家族脱乙酰酶可以影响衰老，主要是通过基因座，特异性调节衰老相关的染色质结构和多种调节蛋白的活性。例如，哺乳动物 Sirt1 通过调节 DNA 甲基转移酶 1/3A/3B（Dnmt1/3A/3B）的活性能维持 DNA甲基化，调节表观遗传的改变[32]；Sirt7 通过募集 DNA 甲基转移酶 1 和 Sirt1 介导 rRNA基因的异染色质形成，维持 rDNA 和基因组的稳定性[33]。在老化过程中

Leydig细胞,标尺,特异性,细胞

图 1 Leydig 细胞 3β-HSD 特异性染色（标尺：A=100 μm，B=50 μm，C=20 μm）图 2 正常组和衰老组 Leydig 细胞 β-半乳糖苷酶衰老染色（标尺=100 μm）（A 正常组；B 衰老组）2.5 MTT 筛选单体化合物作用最适浓度（1）淫羊藿苷浓度筛选：浓度梯度设置为 10 μM、20 μM、40 μM、80 μM 和 160 μM，作用于培养了 48 h 的细胞。各浓度药物在细胞中分别继续作用 24 h、48 h 和 72 h 后，

【参考文献】