黄蜀葵花总黄酮对慢性难愈性创面修复作用及其效应机制研究

发布时间：2020-10-14 12:24

　　 背景:慢性难愈性创面是临床常见的疾病和难题,治疗周期长,效果不理想,严重影响患者的康复和生活质量。血管新生是创面修复的重要环节,大量新生的血管可以提供足够的营养基础和分泌有效物质,有利于肉芽增生,加速创面修复。中医药治疗疮疡历史悠久,疗效独到,其“生血”、“生肌”理论符合现代医学之血管新生的概念和内涵。中药黄蜀葵花被称为“疮家要药”,临床上对痈、疽、疗疮所致的溃疡疗效肯定。黄蜀葵花总黄酮是黄蜀葵花的主要有效成分,具有与黄蜀葵花相似的药理作用。我们前期研究发现黄蜀葵花总黄酮能促进血管生成。因此推测,黄蜀葵花总黄酮可能是基于促血管生成作用而促进创面愈合,但其具体内在机制和作用靶点尚不清楚。目的:观察黄蜀葵花总黄酮对慢性难愈性创面修复作用,并从促血管生成角度探讨其内在机制和作用靶点,为临床运用黄蜀葵花总黄酮提供实验依据。方法:实验一:从整体层面观察黄蜀葵花总黄酮对慢性难愈性创面的疗效,并分析其可能机制。首先采用激素诱导的方法建立慢性难愈性溃疡大鼠模型,在建模成功后随机分为5组进行处理:阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(rb-bFGF)、低剂量TFA组(50mg/ml TFA)、中剂量TFA组(l00mg/mlTFA)和高剂量TFA组(200mg/mlTFA)。在干预后的第3、7、14、21d,观测各组大鼠创面面积和创面愈合率,并进行组织病理学观察,同时利用免疫组织化学法、免疫荧光检测法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和实时荧光定量(Real-TimePCR)等分子生物学方法检测各组大鼠创面组织中与血管生成相关的细胞因子如 VEGF、VEGFR2、AngⅠ、AngⅡ和 eNOS 等表达水平。实验二:在离体层面观察黄蜀葵花总黄酮的促血管生成作用并分析其内在机制。通过体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为4组:正常对照组(完全培养液)、抑制剂组(10μmol/LLY294002 预处理)、TFA 干预组(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL 的 TFA 分别为低、中、高剂量)、抑制剂+TFA干预组(10μmol/LLY294002预处理后,加5μg/mL、100μg/mL、20μg/mL的TFA分别为低、中、高剂量)。运用CCK8化学检测法、划痕实验、Transwell实验和管腔形成等方法观察黄蜀葵花总黄酮对血管新生的关键环节如细胞增殖、迁移和管腔形成的影响,同时采用RT-q-PCR和Western Blot检测VEGF-A/VEGFR 2-PI3K/Akt信号轴中各通路因子的变化。实验三:再次从活体层面观察黄蜀葵花总黄酮的促血管生成作用及与PI3K/Akt信号通路的关系。首先制备鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM),随机分为4组:正常对照组、抑制剂组(10μmol/LLY294002 预处理 1h)、TFA 干预组(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL 的 TFA 分别为低、中、高剂量)、抑制剂+TFA干预组(10μmol/LLY294002预处理1h后,加5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的TFA分别为低、中、高剂量)。在干预后第7d,观察记录鸡胚存活率及存活天数;观察鸡胚绒毛尿囊膜的血管数量。结果:1.本实验通过在大鼠创面局部多处肌内注射氢化可的松成功建立慢性难愈性溃疡大鼠模型;成功建立鸡胚绒毛尿囊膜模型。2.黄蜀葵花总黄酮可减少慢性难愈性溃疡模型大鼠的创面面积,提高创面愈合率,具有促进创面修复的作用。3.黄蜀葵花总黄酮可以促进慢性难愈性创面肉芽组织增生,成纤维细胞增殖和胶原纤维沉积,增加毛细血管密度和成熟。4.黄蜀葵花总黄酮可以增加慢性难愈性大鼠创面与血管生成相关的细胞因子如VEGF、VEGFR2、AngⅠ、AngⅡ和eNOS等表达,提示黄蜀葵花总黄酮促进慢性难愈性创面的愈合很可能是通过促血管生成和调控血管生成的相关信号通路。5.黄蜀葵花总黄酮能促进体外培养的HUVECs增殖、迁移和管腔形成能力,上调VEGF-A、VEGFR2的表达水平和PI3K、Akt的磷酸化水平,从而促进血管生成。6.PI3K/Akt抑制剂LY294002能抑制黄蜀葵花总黄酮诱导的HUVECs增殖、迁移和管腔形成,降低黄蜀葵花总黄酮诱导上调的VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt信号通路因子的表达。7.黄蜀葵花总黄酮可以增加鸡胚绒毛尿囊膜模型血管数量,促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。8.PI3K/Akt抑制剂LY294002在活体层面同样能抑制黄蜀葵花总黄酮诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。结论:黄蜀葵花总黄酮能促进慢性难愈性创面愈合,该药理学效应与黄蜀葵花总黄酮的促血管生成作用有关,其内在机制和作用靶点是通过激活VEGF-A/VEGFR2-PI3K/Akt信号轴。本研究为黄蜀葵花总黄酮作为一种血管生成促进剂,应用于血管相关性疾病如创伤愈合和缺血性损伤等提供了实验依据,同时为黄蜀葵花总黄酮的中药现代化提供理论支撑。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

３．?２大鼠的创面情况观察??３．?２．?１各组大鼠的创面愈合情况比较??大鼠创面愈合情况如图２－１和表２－５所示。??Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＴＦＡ?ＴＦＡ?ＴＦＡ??（ＮＳ）?（ｒｂ－ｂＦＧＦ）?５０ｋｇ／ｋｇ?ｌＯＯｋｇ／ｋｇ?２００ｋｇ／ｋｇ??名ｍｉ］??Ｄ?１４ｐ??ａｙ＿??图２－１各组大鼠创面愈合的形态学观察??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ??２５??

３．?２．?２各组大鼠的创面面积比较??根据ＣＡＤ软件测得各阶段ＳＤ大鼠创面愈合面积，用软件勾出需要计算的面积查询相??关参数，得到该区域的面积，结果如表２－６和图２－２所示。结果显示：造模后第３ｄ，各组??创面愈合无显著性差别（Ｐ＞０．０５）；造模后第７、１４、２１ｄ，阳性对照组和低中高剂量ＴＦＡ??组

血管数量和分布情况。Ｍａｓｓｏｎ染色也是利用不同的染液使胞核、胶原纤维和肌纤维呈现??不同的颜色，用以观察和区分组织中胶原纤维、肌纤维以及炎性因子。ＨＥ染色和Ｍａｓｓｏｎ染??色病理结果如表２－８和图２－３、图２－４所示。??表２－８各组大鼠创面病理切片观察??Ｔａｂｌｅ?２－８?Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｅｃｔｉｏｎｓ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??Ｇｒｏｕｐ?Ｄａｙ?３?Ｄａｙ?７?Ｄａｙ?１４?Ｄａｙ?２１??ＮＧ?间质水肿，大量间质仍有水肿和炎细胞数量较前见少量炎细胞、异??炎细胞浸润以中炎细胞浸润，炎细减少，成纤维细胞物及异物巨细胞，??性粒细胞为主，胞数量较前减少。已产生多量胶原成纤维细胞已产??可见成纤维细成纤维细胞已产纤维，在局部沉生多量胶原纤维，??胞、毛细血管和生胶原纤维，在局积，可见新生上皮在局部沉积，上皮??少量胶原沉积，部沉积，无上皮再?分化一般??边缘无上皮再生生??ＰＧ?间质水肿，中等间质局部水肿，炎间质无水肿，炎细无炎性细胞分布，??量炎细胞浸润
【参考文献】

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本文编号：2840656