知母—黄柏药对体内化学成分及药代动力学研究

发布时间：2020-10-15 20:57

　　 目的:1.研究知母-黄柏药对在正常和糖尿病模型大鼠体内成分;2.建立芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂苷BII、黄柏碱、木兰花碱7种成分的血药浓度检测方法,探讨知母-黄柏药对给药后,7种成分在正常和糖尿病模型大鼠体内药代动力学行为差异;3.研究黄柏碱在大鼠体内代谢产物及代谢途径。方法:1.采用UHPLC-LTQ-OrbitrapXL技术,分析在知母-黄柏药对给药后,正常和糖尿病大鼠体内成分,糖尿病模型采用高脂高糖饲料喂养一个月后腹腔注射35mg·Kg-1链脲佐菌素(STZ)建立。色谱条件:色谱柱为 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150 mmX2.1 mm,3.5 μm);流动相A为含有0.1%甲酸的超纯水,流动相B为乙腈;梯度洗脱,0～40min,5%～14%B;40～60 min,14%～30%B;60～80 min,30%～50%B;80～90 min,50%～95%B;90～95 min,95%B;流速 0.2 mL.min-1;柱温 30 ℃;PDA 检测波长范围为 200~600 nm;前3 min进废液。质谱条件:离子源为电喷雾ESI源;使用碰撞诱导解离(CID)模式;正离子模式电喷雾电压为4 kV;负离子模式喷雾电压为-3.5 kV;鞘气(ShG)为45 arb;雾化温度为325℃;辅助气(AG)为5 arb;吹扫气(SwG)0 arb;一级质谱采用傅里叶变换质谱(FTMS)扫描模式,分辨率为30000;二级质谱采用数据依赖扫描;分辨率为15000;碰撞能为35 eV。鉴别方法:通过比较相同实验条件下得到的知母-黄柏药对水煎液的色谱质谱信息,给药后样品与空白样品以及对照品的色谱质谱信息比较,对比参考文献等方法加以确认。2.通过UHPLC-LTQ-Orbitrap XL和岛津液相色谱-API4000+型三重四级杆质谱联用仪(LC-MS/MS),检测芒果苷、新芒果苷、知母皂苷C、知母皂苷N、知母皂苷BⅡ、黄柏碱、木兰花碱7种成分在正常和糖尿病组大鼠体内血药浓度。正常和糖尿病大鼠各6只,采用单次灌胃给药知母-黄柏药对水提物冻干粉0.16 g·Kg-1的CMC-Na混悬液(芒果苷9.36 mg·Kg-1、新芒果苷18.592mg· Kg-1、知母皂苷BⅡ 85.84mg·Kg-1、知母皂苷N 3.68 mg·Kg-1、知母皂苷C 5.104 mg·Kg-1、黄柏碱3.856mg·Kg-1、木兰花碱 0.885 mg·Kg-1)后,测定给药后 0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、11和24 h正常和糖尿病大鼠各成分血药浓度,用DAS软件计算各成分的药代动力学参数,并用SPSS统计相关参数,比较两组间差异。黄柏碱、木兰花碱的测定:采用岛津液相色谱-API4000+型三重四级杆质谱联用仪(LC-MS/MS),内标为乌头碱,采用甲醇沉淀蛋白法处理样品。色谱柱为ZORBAX EclipseXDB-C18柱(2.1×150mm,5 μm);流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱(0-1min,10%-600%B;1-6min60%B),流速 0.2mL.min-1,柱温 30 ℃,进样量10 μL。离子源为电喷雾ESI源,喷雾电压IS为4000 V;雾化温度为450℃;气帘气CUR为40;碰撞气CAD为10;雾化气GAS1为50;检测方式为正离子多离子反应监测(MRM),用于定量分析的离子对分别为342.3→297.2(木兰花碱),342.3→192.1(黄柏碱)。芒果苷、新芒果苷、知母皂苷N、知母皂苷C、知母皂苷BⅡ的测定:采用UHPLC-LTQ-OrbitrapXL技术,内标人参皂苷Rg2,采用甲醇沉淀蛋白法处理样品。色谱柱为CORTECS(?)UPLC(?)C18(2.1×100mm,1.6μm),流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为乙腈,梯度洗脱(0-10 min,6-30%,前2.5 min进废液;10-18 mmin,30-40%;18-20min,40-90%),流速 0.2mL·min-1,柱温 30℃,进样量 10 μL,分析时间 20 min。离子源为电喷雾ESI源,碰撞诱导解离(CID)检测模式,电喷雾电压为3.5 KV,鞘气(ShG)为45 arb,雾化温度为325℃,辅助气(AG)为5 arb,吹扫气(SwG)0 arb,分辨率为30000,质量扫描范围m/z为200-1200。3.采用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL技术,在灌胃给药黄柏碱80mg·Kg-1后,检测大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便中所含的代谢产物。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 × 150 mm,3.5 μm);流动相A为0.1%的甲酸,流动相B为乙腈,梯度洗脱(0～40 min,5%～14%B,前 3 min 进废液),流速 0.2 mL·min-1,柱温 30℃。离子源为电喷雾ESI源,检测方式为正离子碰撞诱导解离(CID)模式,电喷雾电压为4.5 KV;鞘气(ShG)为45arb,雾化温度为325℃,辅助气(AG)为5arb,吹扫气(SwG)0 arb,碰撞能为30 eV。MS1采用傅里叶变换质谱(FTMS),分辨率为30000,质量扫描范围为215-900。MS2和MS3采用数据依赖扫描(DDS),分辨率为15000。代谢产物的鉴别:利用UHPLC-LTQ-OrbitrapXL,比较给药后样品与空白样品色谱图,初步筛选可能的代谢产物峰,而根据已有的代谢生物转化类型和黄柏碱的结构逆向推测其可能的代谢产物分子量和分子结构,然后在色谱和质谱中查看是否存在,若存在,则需要对其碎片信息进行考察,来确定其是否为黄柏碱的代谢产物。结果:1.通过本次研究,在知母-黄柏药对给药后,大鼠血浆中共鉴别了原型成分16个,其中检测的黄酮类、皂苷类、有机酸类成分共10个,来源于知母;检测的生物碱类成分6个,来源于黄柏;代谢产物11个,其中芒果苷类代谢产物6个,生物碱类代谢产物5个,正常组和糖尿病组大鼠所含成分种类无差别。2.通过液质联用技术,对芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C、黄柏碱、木兰花碱7个主要成分血药浓度检测方法学考察,各成分在检测条件下,线性关系良好,R均大于0.9958,准确度为(90.48±6.58)%-(108.54±5.71)%,日内和日间精密度(RSD)均≤10.54%,各条件下稳定性结果均在(87.92±2.24)%-(110.52±3.24)%之间,专属性好。分别给予正常组和糖尿病组大鼠0.16 g·Kg-1知母-黄柏药对水煎液冻干粉,由建立的定量方法测得知母皂苷N和黄柏碱在糖尿病组大鼠的AUC0~t显著大于正常组,而知母皂苷C和黄柏碱的Cmax在糖尿病组大鼠显著高于正常组。3.通过高分辨质谱和LC-MS"技术,共鉴别了黄柏碱在体内的25个代谢产物。其代谢形式主要有葡萄糖醛酸化、羟基化、脱氢、脱甲基、甲基化等。其中葡萄糖醛酸化的代谢产物主要鉴别于胆汁、尿液、血浆样品中,羟基化和脱甲基化的代谢产物主要鉴别于粪便样品中。结论:本文利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL高分辨多级液质联用系统,在知母-黄柏药对给药后,鉴别正常和糖尿病大鼠血浆所含成分种类无差异。表明正常和糖尿病病理模型对知母-黄柏药对中药物成分进入血液中的种类无影响。但利用液质联用技术,研究芒果苷、新芒果苷等7个主要成分在正常和糖尿病大鼠中的药代动力学行为,发现:糖尿病大鼠中新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷N、知母皂苷C和黄柏碱5个成分AUC0~t Cmax均值均高于正常组,但无统计学意义;知母皂苷N的AUC0~t和知母皂苷C的Cmax均值都是糖尿病组显著高于正常组,而黄柏碱的AUC0~t和Cmax的均值在糖尿病大鼠均显著高于正常组,说明糖尿病病理模型对部分成分的吸收和利用有影响,这可能与其发挥降糖药理作用相关。由于黄柏碱在两种生理模型下药代动力学行为的差异显著,本文利用UHPLC-LTQ-Orbitrap XL高分辨多级液质联用系统,研究知母-黄柏药对中代表性成分黄柏碱在大鼠血浆、胆汁、尿液、粪便样品中的代谢情况,共鉴别黄柏碱的代谢产物25个,代谢产物主要通过葡萄糖醛酸化、羟基化、脱氢、脱甲基、甲基化代谢转化而来。综上所述,本研究为知母-黄柏药对降糖作用物质基础的体内成分以及体内成分的药代动力学和代表成分的药物代谢方面提供了一定的科学依据。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285.5
【部分图文】：

广州中医药大学２０１７届硕士学位论文??知母皂苷ＢＩＩ、知母皂苷Ｎ、知母皂苷Ｃ、黄柏碱、木兰花碱不同采血时间点的血药浓??度。实验所测得的血药浓度－时间数据采用ＤＡＳ?２．０软件，计算相关药代动力学参数，??并用ＳＰＳＳ?２２软件统计分析。??３．３实验结果??３．?３．?１方法学考察??３．?３．?１．?１专属性考察??黄柏碱、木兰花碱：在选定的测定条件下，黄柏碱、木兰花碱、乌头碱（内标）??的生成的基峰离子［Ｍ＋Ｈ］＋，并将其作为母离子，在相应的扫描条件下得到对应成分的子??离子扫描图，见图３－１。分别取来自６个不同个体的大鼠空白血浆混合，加入两种待??测成分和内标对照品，在选定的检测条件下，黄柏碱、木兰花碱和内标的保留时间分??别为４．?５３，?４．５５和４．?８４?ｍｉｎ。３种分析成分峰形良好，分离完全，不受血浆中内源??性物质的干扰。空白血浆，空白血浆加黄柏碱、木兰花碱和乌头碱（内标）标准品，??以及大鼠知母－黄柏药对给药后血浆样品的色谱图见图３－２。??脱１．５８６５??

芒果苷、新芒果苷、知母皂苷ＢＩＩ、知母皂苷Ｎ、知母皂苷Ｃ：在质谱分辨率为??３００００的前提条件下，待测成分的质荷比在扫描范围，芒果苷４２１．?０５７－４２１．?０９７、??新芒果?５８３．?１１０－５８３．?１５０、知母皂苷?ＢＩＩ?９１９．?４７０－９１９．?５１０、知母皂苷?Ｎ??９８１．４６０－９８１．５００、知母皂苷?Ｃ?９０１．４５５－９０１．４９５、人参皂苷?Ｒｇ２?（内标）??８２９．?４７０－８２９．?５２０下，各成分峰形较好，分离完全，基质干扰少。各成分的色谱图见??

３．３．?１．２标准曲线和定量下限??分别精密吸取２００?ＵＬ黄柏碱和木兰花碱储备液，置于同一个１０?ｍＬ的容量瓶中，??用３０％乙腈－０．１％甲酸水定容，配制成黄柏碱２３４０?ｎｇ＿ｍＬ＇木兰花碱２０００?ｎｇ．ｍｌ；１的??标样，再用３０％乙腈－０．?１％甲酸水依次配制成相应浓度的系列标样，各取系列标样１０??ｙＬ，加入１００?ｙＬ空白血浆中，配制终浓度为黄柏碱１１７．０、５８．５、２３．４、１１．７、５．?８５、??２．３４、１．１７?ｎｇ．ｍＬ—１?和木兰花碱?１００、５０、２０、１０、５、２、１?ｎｇ．ｍｌ／１?的系列标准血样；??分别精密吸取５００?ｙＬ芒果苷储备液、１００?ｕＬ新芒果苷储备液、２５０?ｕＬ知母皂苷??ＢＩＩ储备液、５０?ｙ?Ｌ知母皂苷Ｎ储备液和１００?ｙ?Ｌ知母皂苷Ｃ储备液于同一个１０?ｍＬ??容量瓶中，加入５０％甲醇溶液定容，配制成浓度分别为芒果苷５６００?ｎｇ＿ｉｎＬ＇新芒果??苷?１０００?ｎｇ＿ｎｉＬ＿１、知母皂苷?ＢＩＩ５１００ｎｇ＿ｍＬ＿１、知母皂苷?Ｎ５００ｎｇ＿ｍＬ＿Ｉ和知母皂苷?Ｃ９８０??ｎｇｍｌ；１的标样，再用５０％甲醇溶液配制成对应浓度的系列标样，，各取系列标样２０?ｕ?Ｌ，??２８??
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本文编号：2842236