二至丸原名女贞丹,仅由女贞子和墨旱莲两味中药组成,始载于明代吴旻汇编的《扶寿精方》,具有补益肝肾、滋阴止血的作用,主要用于肝肾阴虚引起的眩晕耳鸣,鼻燥咽干,腰膝酸痛,月经量多。古书记载其能“旬日间膂力加倍。发白返黑。健腰膝。强阴不足。能令老者。无夜起之劳。”近年来有学者提出“人之衰老,以肝肾阴虚为本,而治疗大法,当以滋补肝肾之阴为先。”目前已有多篇文献报道二至丸具有抗衰老作用,但其抗衰老的机制尚未明确,使其临床应用受到了限制,需要在细胞层面上深入研究。本论文建立了二至丸及其提取物质量的整体评价方法,为后续实验提供了质量稳定的样品;建立了大鼠肾(NRK)细胞衰老模型,并基于此模型考察了不同提取方法酒女贞子组方制成的二至丸的体外抗衰老作用;以中药血清药物化学方法定性分析二至丸血中移行成分,并定量分析主要成分特女贞苷和红景天苷;基于细胞代谢组学技术研究二至丸含药血清对衰老NRK细胞的保护作用,探讨二至丸抗衰老的可能机制。论文研究内容主要包括以下五个部分:一、文献研究查阅中外文献,对比多种细胞衰老造模方法的异同,系统总结归纳多种细胞衰老的检测方法的优缺点,选择切实可行的检测方法,为进一步NRK细胞衰老模型建立以及二至丸体外抗衰老研究做铺垫。二、基于C30-HPLC与层次分析法的二至丸及其提取物质量评价方法研究基于多指标成分定量的质量评价方法一直是中药复方质量研究的重要内容之一。复方二至丸由酒女贞子的全粉和墨旱莲水煎液浸膏所组成,《中国药典》2015版仅针对单一成分特女贞苷进行含量测定,尚不能说明复方中药的内在质量。本研究以药典规定的复方及其组方药材质控成分特女贞苷、蟛蜞菊内酯与主要活性成分红景天苷、女贞苷、齐墩果酸、熊果酸为测定对象,建立了具有良好精密度、准确度和重复性的C30-HPLC含量测定方法,用于4种不同制备方法的二至丸样品与4种不同溶剂系统提取的二至丸提取物的多成分定量分析,并使用层次分析法(AHP)对定量结果进行综合分析,分析结果与体外抗氧化实验(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法,DPPH法)相符合,该方法为二至丸及其它中药复方质量评价方法的改进提供了参考和借鉴。三、二至丸血中移行成分定性定量研究1.基于UFLC-Q-TOF-MS技术的二至丸血中移行成分定性分析采用UFLC-Q-TOF-MS对二至丸含药血清进行分析。本实验采用AB SCIEX Triple TOFTM 5600高分辨质谱,采用TOF MS-IDA-MS/MS模式采集数据,借助Peak View SoftwareTM质谱分析软件,通过软件内置的XIC Manager插件对采集的数据进行靶向化合物鉴别。共鉴别出27种二至丸移行成分,其中18种来自酒女贞子,7种来自墨旱莲,其中木犀草素、芹菜素为两者所共有。鉴别的化合物涵盖黄酮类、苯乙醇类、环烯醚萜类、三萜类、酚类等不同类别,为解释二至丸药效以及血中移行成分定量打下基础。2.二至丸血中主要移行成分定量分析对二至丸血中主要移行成分红景天苷、特女贞苷进行含量测定。采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用(UPLC-MS/MS)技术,色谱分离条件:ACQUITY UPLC(?)BEHC18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色谱柱;以乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)为流动相梯度洗脱,流速:0.3mL·min-1,柱温:30℃;质谱条件:采用电喷雾(ESI)离子源,在负离子模式下对各化合物进行多反应监测模式(MRM)检测。空白血清检测红景天苷、特女贞苷均无基质效应,红景天苷与特女贞苷可以很好的分离,无干扰。测得二至丸组红景天苷、特女贞苷含量为3.19、0.10 μg·mL-1,EZW-3组红景天苷、特女贞苷含量为22.29、0.14μg·mL-1。本方法可为二至丸含药血清提供质量控制。四、二至丸对D-半乳糖诱导NRK细胞衰老的保护作用使用不同浓度D-半乳糖(1、5、10、20、40 g.L-1)作用不同时间(24、48、72h)诱导NRK细胞衰老,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)染色法鉴定细胞衰老;荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)法检测衰老相关的β-半乳糖苷酶活力;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力;以GSH-PX、SOD活力与MDA含量检测细胞氧化应激水平。综合评价NRK细胞衰老模型成功与否。根据FDG结果评估不同浓度的二至丸样品(EZW-1、EZW-2、EZW-3,10、100、500和1000 mg·L-1)对衰老NRK细胞的影响,检测GSH-PX、SOD活力与MDA含量的变化,探讨二至丸对衰老NRK细胞的保护作用。与对照组相比,模型组(20 g·L-1 D-半乳糖处理48 h)β-半乳糖苷酶染色阳性率显著增加,β-半乳糖苷酶活力显著增加;GSH-PX、SOD活力下降,MDA含量增加,细胞活力无明显变化。与模型组相比,给药组β-半乳糖苷酶活力明显降低,阳性染色率显著下降,GSH-PX、SOD活力升高,MDA含量明显降低。表明二至丸能够减轻D-半乳糖诱导的NRK细胞衰老的程度,其保护效应可能与二至丸抗氧化应激效应相关,且不同的二至丸样品抗衰老的结果具有差异性,EZW-1的抗NRK细胞衰老效果优于 EZW-2、EZW-3。五、基于细胞代谢组学技术研究二至丸对衰老NRK细胞的保护作用1.二至丸含药血清对衰老NRK细胞的保护作用以含药血清浓度(5%、10%、20%),给药时间(24、48、72 h),含药血清种类(二至丸含药血清、EZW-3含药血清)为影响因素,以细胞内β-半乳糖苷酶活力为评价指标,设计正交实验,优选二至丸含药血清作用的条件:20%的EZW-3含药血清作用衰老NRK细胞48 h。对比空白血清组,含药血清组的NRK细胞的衰老状态得到显著改善。2.二至丸抗NRK细胞衰老的细胞代谢组学研究采用D-半乳糖复制NRK细胞衰老模型,借助气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术,对各组细胞样本进行测定,采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)等多种方法进行模式识别,采用Kruskal-Wallis非参数检验及Dunn's多重比较进行单变量统计分析。经PLS-DA模式识别分析,对照组、模型组和给药组细胞样本能够得到很好的区分。根据PLS-DA模型的变量投影重要性(VIP)及单变量分析的P值筛选出对分类有显著贡献的代谢物,通过与NIST 2014标准数据库内置的参考光谱进行质谱匹配来鉴定代谢产物,共鉴定出33种潜在生物标志物,给药组的衰老NRK细胞胞内的内源性代谢物水平有不同程度的恢复。二至丸可以使D-半乳糖诱导的衰老NRK细胞胞内的异常代谢有所恢复,其治疗作用可能与苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油脂代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、肌醇磷酸酯代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)等10条通路的调节有关。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
?２００．００?２４０．００?２８０．００?＾?３２０．００?３６０．００?２００．ＵＵ?２４０．００?２８０．００?＾?３２０．０Ｕ?３６０．００??图２－１－１红景天苷（Ａ），特女贞苷（Ｂ），女贞苷（Ｃ），蟛蜞菊内酯（Ｄ），齐墩果酸??（Ｅ）和熊果酸（Ｆ）的紫外光谱图??３．３色谱柱的选择??Ｃ１８柱对齐墩果酸和熊果酸的分离度小于１．５?（图２－１－２?Ｃ），无法进行定量??分析。当Ｃ３〇柱取代Ｃ１８柱时，分离度可达２．８０?（图２－１－２?Ｂ），满足定量分析的??要求。表明了?Ｃ３Ｑ柱在分离同分异构体时比Ｃ１Ｓ柱具有更好的分离度。多层键合??相的Ｃ３Ｑ柱可在硅胶表面形成更为致密的Ｃ３Ｑ烷基链，相比Ｃ１８柱，Ｃ３Ｑ柱更长??的烷基链具有更强的疏水性
图２－１－３二至丸质量评价层次模型??
女贞苷?３．６６０??蟛蜞菊内酯?０．０４５??齐墩果酸?０．３２１??熊果酸?０３２４表２－１－５九点数值表??同等重要??稍重要??明显重要??强烈重要??绝对重要??以上重要性的中间值??若ｉ与ｊ的重要性之比为，贝ｊ?ｊ与ｉ的－??
【参考文献】
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本文编号：
2842499
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