天然产物芒果苷(mangiferin,M)作为一种氧杂蒽酮糖苷类化合物在降脂、降糖、减肥、抗炎和抗氧化方面表现出良好效果,天然产物小檗碱(berberine,B)作为一种异喹啉类生物碱在调节糖脂代谢方面也表现出良好药理活性。本研究首先运用化学方法将M和B通过离子键连接形成单一的稳定分子,制备新化合物芒果苷小檗碱(mangiferin-berberine,MB)盐,然后对MB盐在HepG2细胞中调控糖脂代谢的活性和机制进行了深入研究,并与M或B单独应用进行了对比。首先利用MTT法检测了 M,B,MB盐三个化合物的体外毒性,以期为后续实验药物处理浓度的选择提供参考。接着Western Blot实验检测化合物对腺苷酸依赖的蛋白激酶 α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα)第 172 位苏氨酸(Thr172)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACC)第79位丝氨酸(Ser79)磷酸化水平的影响,以试剂盒检测化合物对肉毒碱棕榈酰基转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)活力的影响。在调节糖类代谢方面,通过试剂盒检测三个化合物对基础水平以及胰岛素刺激的糖消耗的促进作用;通过试剂盒检测三个化合物对HepG2细胞糖异生的抑制作用,与此对应,通过反转录和实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)检测三个化合物对糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)mRNA表达水平的影响。在调节脂类代谢方面,首先通过qPCR的方法检测三个化合物对低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)mRNA 表达水平的影响,接着利用油酸(oleic acid,OA)造模,建立HepG2细胞脂肪变性模型,通过油红O(ORO)染色法以及测定细胞内三酰甘油(triglyceride,TG)含量的方法观察三个化合物降低细胞内脂肪的作用,与此对应利用qPCR的方法检测细胞脂肪合成关键转录因子如固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)和碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate-responsive element-binding protein,ChREBP)及其靶基因如脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)和固醇辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1)的 mRNA 表达水平。利用 AMPK 特异性抑制剂compound C(CC)进行阻断实验。结果发现,在HepG2细胞内化合物M对细胞生长的的半数抑制浓度(IC50)大于400μM,化合物B对HepG2细胞生长的IC50为133.9±10.6μM,化合物MB盐对HepG2细胞生长的IC50为131.0±9.4μM。结果还表明三个化合物均能剂量依赖地促进AMPK-α(Thr172)磷酸化、ACC(Ser79)磷酸化并增加CPT1活力,并且这些作用均能被CC预处理所完全阻断。MB盐刺激AMPK通路的效果显著优于同等摩尔浓度的M或B单独应用。在调节糖类代谢方面,三个化合物均能促进基础水平糖消耗和胰岛素刺激的糖消耗,且MB盐的效果明显优于同等摩尔浓度的M或B单独应用。B和MB盐能促进细胞乳酸释放,而M没有效果。MB盐中的M部分通过AMPK依赖的方式来促进细胞糖消耗,而其中的B部分通过AMPK非依赖的途径来促进糖消耗;MB盐促进细胞糖消耗的作用部分依赖于AMPK,而促进细胞乳酸释放的作用不依赖于AMPK。另外,MB盐显著抑制细胞糖异生,并且其作用也优于M或B单用,且该作用依赖于AMPK。MB盐在抑制糖异生的过程中能够显著下调糖异生关键酶PEPCK和G6Pase的mRNA表达水平。在调节脂类代谢方面,MB盐能显著抑制OA诱导的细胞脂肪变性,降低细胞内TG含量,下调SREBP-1c,ChREBP,Fas,SCD1mRNA表达水平,其效果显著优于同等摩尔浓度的M或B单独应用,且MB盐的这种作用依赖于AMPK的激活。MB盐在体外调控糖脂代谢的活性与同等摩尔浓度的M加B联合应用(M+B)相当,但作为稳定的单一分子,MB盐在体内可能更易吸收,具有更好的药代动力学参数。本研究表明,新化合物MB盐通过激活AMPK/ACC/CPT1通路以及抑制脂肪合成基因的表达来降低细胞内TG的含量;通过激活AMPK下调PEPCK和G6Pase的表达来抑制细胞糖异生;分别通过激活AMPK(M)和促进乳酸释放(B)来刺激糖消耗。MB盐在HepG2细胞中调节糖脂代谢的效果显著优于单用M或B。该化合物结合了 M和B的优点,有望将来开发用于治疗糖脂代谢紊乱。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
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【参考文献】
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2843080
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