中药灵芝的鉴别及含量测定方法研究
发布时间：2020-10-17 09:33
目的:建立灵芝的特异性PCR鉴别方法;分别建立测定灵芝药材中麦角甾醇、尿苷和腺苷、灵芝酸A的高效液相色谱方法,为完善灵芝药材质量控制提供参考方法,同时比较不同产地灵芝中三类化合物的含量差异。方法:第一,收集12批灵芝药材,依据《中国药典》规定,对这些药材的性状、水分、总灰分、浸出物、显微鉴别等项目进行检查。第二,建立特异性PCR鉴别方法。第三,建立高效液相色谱含量测定方法。1.灵芝药材中麦角甾醇的含量测定方法。色谱条件:色谱柱为Welch Ultimate LP-C_(18)柱(4.6×150mm,5μm),流动相100%甲醇,流速1ml/min,柱温26℃,DAD检测,波长283nm,进样量5μl;同时对方法学进行考察。2.灵芝药材中尿苷和腺苷的含量测定方法。色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×150mm,5μm);流动相甲醇(A)-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(B)梯度洗脱,比例A%:5%(0min)→5%(10min)→13%(15min)→13%(25min),流速0.8mL/min,柱温26℃,DAD检测,波长260nm,进样量对照品3μl,供试品10μl;同时对方法学进行考察。3.灵芝药材中灵芝酸A的含量测定方法。色谱条件:色谱柱为Welch Xtimate~(TM)-C_(18)柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈-0.01%醋酸(体积比37:63),流速为1mL/min,柱温30℃,进样量10μL,蒸发光散射器漂移管温度为105℃,空气流速2.8L/min;同时对方法学进行考察。结果:灵芝药材的性状、水分、总灰分、浸出物、显微鉴别等都符合《中国药典》的规定;建立的特异性PCR鉴别方法,凝胶成像结果条带单一清晰;麦角甾醇的回归方程为Y=1531.1X+3.358(r=1),进样量在0.0832~1.664μg范围内与峰面积具有良好的线性关系,其平均加样回收率为98.68%(RSD=1.9%);尿苷、腺苷的回归方程分别为Y=7.5404X-10.409(r=0.9998),Y=27.845X-9.2962(r=0.9999),浓度分别在2.825~90.4μg/mL、0.985~98.5μg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系,尿苷、腺苷平均加样回收率为97.22%(RSD=0.56%),97.71%(RSD=0.60%);灵芝酸A的回归方程为Y=1.765X+5.5352(r=0.9998),进样量在0.8928~5.3568μg范围内,峰面积的对数值与进样量的对数值具有良好的线性关系;其平均加样回收率为95.81%(RSD=0.8%)。结论:本研究建立的特异性PCR鉴别方法能够快速、简单地进行操作,结果准确;而三种HPLC含量测定方法,操作简便、结果准确、重现性好,可为灵芝的质量控制提供参考方法;同时测定的不同产地的灵芝药材,三类化合物的含量差别较大,质量参差不齐,购买和使用是一定要注意其质量问题。
【学位单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：
表 1 灵芝药材来源信息表号 批号 产地 供样单位L1 160106 云南 蚌埠市九州大药房L2 160327 吉林 蚌埠市绿十字医药连锁有限公L3 160411 山西 蚌埠市瑞康大药房L4 20150818 山东 安徽新兴中药材饮片有限公司L5 1512079 吉林 蚌埠市中医医院L6 1606108 安徽 亳州千草药业有限公司L7 160709 山西 亳州市永刚饮片厂有限公司L8 20151023 山西 蚌埠市华源大药房L9 160522 安徽 蚌埠市大明药房10 160128 安徽 安徽捷众生物化学有限公司11 — 四川 成都荷花池药材市场12 — 四川 成都荷花池药材市场对收集的十二批灵芝药材样品进行观察并拍照，具体形态见图 1。
LEICADM750 生物显微镜 德国徕卡仪器有限公司齿轮牌载玻片（25.4 × 76.2mm） 上海精轮工业玻璃有限公司世泰显微镜盖玻片（22 × 22mm） 江苏世泰实验器材有限公司飞鹰牌单面保安刀片 上海吉列有限公司水合氯醛试液 自制1.2 实验方法依据 2015 年版《中国药典》四部通则 2001 项下粉末制片法[21]制备。样品粉末过五号筛，挑取少量粉末放置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。1.3 实验结果实验结果见图 2。
增程序：94℃ 5min，35 个循环（94℃ 30s，50℃ 30s，72℃30s），72℃电泳检测脂糖凝胶制备：称取 0.53g 琼脂糖，加入 35ml 1 × TAE 电泳缓冲液为蒸发量，微波炉中火加热至琼脂糖全部融化，冷却至 65℃，加入d，混匀，倒入内槽板，避免气泡的产生，室温下静置至凝固，轻拔样：在封口膜上将扩增产物 1μl 与 5μl 的 6 × loading buffer 混合，用脂糖凝胶的孔内。泳：加样后，立即进行电泳，电压不超过 5V/cm，当溴酚蓝移动到止电泳。测：取出琼脂糖凝胶块，置凝胶成像系统拍照并保存结果。验结果胶成像结果见图 3。
【参考文献】
本文编号：2844604
【学位单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：
表 1 灵芝药材来源信息表号 批号 产地 供样单位L1 160106 云南 蚌埠市九州大药房L2 160327 吉林 蚌埠市绿十字医药连锁有限公L3 160411 山西 蚌埠市瑞康大药房L4 20150818 山东 安徽新兴中药材饮片有限公司L5 1512079 吉林 蚌埠市中医医院L6 1606108 安徽 亳州千草药业有限公司L7 160709 山西 亳州市永刚饮片厂有限公司L8 20151023 山西 蚌埠市华源大药房L9 160522 安徽 蚌埠市大明药房10 160128 安徽 安徽捷众生物化学有限公司11 — 四川 成都荷花池药材市场12 — 四川 成都荷花池药材市场对收集的十二批灵芝药材样品进行观察并拍照，具体形态见图 1。
LEICADM750 生物显微镜 德国徕卡仪器有限公司齿轮牌载玻片（25.4 × 76.2mm） 上海精轮工业玻璃有限公司世泰显微镜盖玻片（22 × 22mm） 江苏世泰实验器材有限公司飞鹰牌单面保安刀片 上海吉列有限公司水合氯醛试液 自制1.2 实验方法依据 2015 年版《中国药典》四部通则 2001 项下粉末制片法[21]制备。样品粉末过五号筛，挑取少量粉末放置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。1.3 实验结果实验结果见图 2。
增程序：94℃ 5min，35 个循环（94℃ 30s，50℃ 30s，72℃30s），72℃电泳检测脂糖凝胶制备：称取 0.53g 琼脂糖，加入 35ml 1 × TAE 电泳缓冲液为蒸发量，微波炉中火加热至琼脂糖全部融化，冷却至 65℃，加入d，混匀，倒入内槽板，避免气泡的产生，室温下静置至凝固，轻拔样：在封口膜上将扩增产物 1μl 与 5μl 的 6 × loading buffer 混合，用脂糖凝胶的孔内。泳：加样后，立即进行电泳，电压不超过 5V/cm，当溴酚蓝移动到止电泳。测：取出琼脂糖凝胶块，置凝胶成像系统拍照并保存结果。验结果胶成像结果见图 3。
【参考文献】
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本文编号：2844604
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