黄芪花资源化学研究

发布时间：2020-10-17 09:41

　　 本论文研究内容属于国家中医药行业科研专项(201407002)、江苏省产学研合作前瞻性联合研究项目(BY2015008-04)和宁夏重点研发计划(东西部合作项目)(2017BY079)的部分研究内容。本论文分为三个章节,主要结果归纳如下:第一章文献研究查阅本草,对黄芪基源植物来源、品种及药用部位进行考证,并对其地上部分相关药用记载及化学成分和药理活性研究进展进行综述,归纳分析了现有关于黄芪花资源化利用的研究专利,探索性提出黄芪花资源开发利用价值与利用途径,以期为黄芪资源的系统利用及产业化开发提供科学依据。第二章黄芪花及地上部分化学成分的分析与评价(一)为明确黄芪花中初生代谢产物组成及分布特征,分别采用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-TQ/MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法和BCA试剂盒法,分别对黄芪花中的初生代谢产物包括核苷与氨基酸类、脂肪酸类、糖类(多糖、单糖和寡糖)和可溶性蛋白成分进行分析与评价。结果表明,黄芪花中共检测到6种核苷类成分(总量为0.28%)和15种氨基酸类成分(总量为0.65%)及丰富的可溶性多糖(4.69%)、果糖(4.55%)、葡萄糖(0.87%)、蔗糖(0.11%)和可溶性蛋白质类(31.48%)成分。此外还检出8种脂肪酸类成分,其中肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸为其主要组成成分。(二)分别采用紫外可见分光光度法、UPLC-TQ/MS和GC-MS法对黄芪花中次生代谢产物包括黄酮类、酚酸类、皂苷类和挥发性成分进行分析与评价。结果表明,黄芪花中总黄酮含量为0.52%,总酚酸含量为3.83%,总皂苷含量为1.62%。黄酮类成分中以金丝桃苷(725.7±6.6 ug·g-1)和异槲皮苷(449.6±1.7 μg·g-1)含量相对较高,而芒柄花素(0.33±0.02,ug·g-1)含量较低。黄芪花中共检测出32种挥发性成分,以含氧衍生物为其主要组成成分。(三)采用UPLC-TQ/MS法分析了7月份不同产地蒙古黄芪和膜荚黄芪不同部位中25种黄酮类、酚酸类及皂苷类化学成分、22种游离氨基酸和核苷类化学成分的分布情况。结果表明,二氢黄酮类、异黄烷类、异黄酮类、黄酮类、紫檀烷类、酚酸类和皂苷类的含量不仅在同一物种的不同器官中,而且在不同物种的同一器官中也存在显著差异。此外,两种不同物种植物中相同类型的化合物的含量显著不同。所有黄芪花样品中以甘肃省岷县麻子川产的蒙古黄芪花中总核苷和氨基酸类成分含量最高,且其主要成分为天冬酰胺。研究结果为黄芪花的资源利用提供了科学支撑。第三章黄芪花生物活性评价与资源价值发现(一)黄芪花抗氧化及神经保护活性研究本节通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除法和Fe3+还原能力(FRAP)法分别对经大孔树脂分离制备的黄芪花五个化学部位进行抗氧化活性评价。结果表明,在五个洗脱部位中,ME(50%洗脱液)部位的清除DPPH自由基(IC50=35.10±0.26 μg.mL-1)、ABTS自由基(IC50=22.02±2.70μg.mL-1)和Fe3+还原能力(3.00±0.13 μmol Fe2+·g-])均最强,并接近BHT阳性对照组。采用UPLC-TOF/MS对抗氧化活性部位ME进行化学成分鉴定,共检测到5 1个化合物,确认了31个化合物的结构(4个酚酸类、19个黄酮类、3个异黄酮类、2个紫檀烷类和3个皂苷类化合物)。采用紫外可见分光光度法、UPLC-TQ/MS法分析了各提取部位中酚酸类和黄酮类化学成分含量,结果显示:ME部位的总酚酸含量(1.87±0.03 mgg1)和总黄酮含量均最高(36.40±1.23 mg.g-1)。其中,金丝桃苷(16.29±0.20 mg.g-1)是ME中主要成分,其次为芦丁(6.10±0.08 mg.g-1)、异鼠李素-3-0-葡萄糖苷(4.97±0.05 mg.g-1)和紫云英苷(4.81±0.03 mg·g-1)。化学成分与抗氧化相关性分析结果表明体外抗氧化能力与总酚酸和总黄酮含量呈较强的相关性,其中咖啡酸和毛蕊异黄酮苷与抗氧化活性相关性最强。研究结果表明黄芪花5 0%乙醇洗脱部位具有较强的抗氧化能力,具有潜在资源化利用价值。此外,基于谷氨酸致HT22细胞的氧化应激损伤模型,研究了黄芪花不同化学部位及其化学单体鼠李柠檬素、紫云英苷、山柰酚、7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷苷、大豆皂苷、芦丁单体抑制谷氨酸毒性下的HT22细胞凋亡活性。结果表明,5个部位中ME部位抑制活性最强,且呈现浓度相关性;各单体化合物均不同程度抑制谷氨酸毒性下的HT22细胞凋亡,其中鼠李柠檬素活性最强,其次为山柰酚,其抑制细胞凋亡活性强于阳性对照Trolox,而芦丁较弱。基于UPLC-QTOF/MS技术对谷氨酸干预的HT22细胞内差异代谢物进行代谢组学分析,结果显示ME部位给药后可能影响了亚硒酸代谢和鞘脂代谢通路。研究结果为研究L-谷氨酸致HT22细胞损伤发生的分子机制和药物作用机制提供基础,也为黄芪花的神经保护药物研发提供了依据。(二)黄苗花防治肺纤维化作用研究本节基于过氧化氢致HELF细胞的氧化损伤体外模型,研究了黄芪花不同化学部位及槲皮素、咖啡酸、山柰酚、异槲皮苷、原儿茶酸和金丝桃苷单体对过氧化氢所致HELF细胞氧化损伤的保护活性。结果表明黄芪花多糖部位(DT)部位保护过氧化氢氧化损伤下的HELF细胞的作用最强,且其作用强度与浓度成依赖性相关。对于6种受试单体化学成分,在等浓度条件下咖啡酸的活性最强。通过气管内滴注博来霉素诱导c57BL/6小鼠肺纤维化体内模型,以黄芪花多糖部位(D T)、黄芪花10%乙醇洗脱液(LE)、黄芪花50%乙醇洗脱液(ME)、黄芪花90%乙醇洗脱液(HE)部位给药21天后,收集血清、尿液及肺组织样本,分别进行生化指标测定、肺组织病理学分析。结果表明,黄芪多糖DT给药后小鼠体重与肺系数均有恢复到正常组的趋势,能显著降低MDA和HYP、TGF-β1和TNF-α含量,改善T-AOC水平,从而发挥防治肺纤维化作用。该结论与在体外模型中的结果一致。基于UPLC-QTOF/MS技术,采用代谢组学研究方法对黄芪花DT、LE、ME、HE部位对肺纤维化小鼠的干预作用机制进行了研究,结果在小鼠血清及尿液样本中鉴定出23种内源性代谢物(血清11种,尿液12种),分别从血清中构建影响值相对较高的7条相关代谢通路,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(1)、花生四烯酸代谢(2)、萜类骨架生物合成(3)、丙酮酸代谢(4)、酪氨酸代谢(5)、色氨酸代谢(6)和半胱氨酸和蛋氨酸代谢(7),影响值分别为0.50、0.35、0.25、0.18、0.14、0.11和0.11。从尿液中构建影响值相对较高的5条相关代谢通路,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢(1)、甲烷代谢(2)、生物素代谢(3)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(4)和类固醇激素生物合成(5),影响值分别为1、0.40、0.30、0.26、0.18。黄芪各部位药物干预后,有8种标志物有一定程度的回调(P0.05),所有样本共涉及了6条代谢通路,分别为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,丙酮酸代谢,酪氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。研究结果从代谢通路方面验证了黄芪花对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠有较好的改善作用。基于中医肺肠轴理论,通过16S rDNA测序的方法研究黄芪花DT、LE和ME部位对肺纤维化小鼠肠道菌群多样性的调节作用机制。研究发现,与对照组比较,肺纤维化模型组小鼠肠道菌群从门分类水平到属分类水平均发生了变化;其中与空白组相比,模型组c57BL/6小鼠肠道菌中Cyanobacteria(蓝藻门)、Erysipelotrichaceae(韦荣球菌科)、Rumini clostridium_1(瘤胃梭菌属)、Ruminococcus_1(瘤胃球菌属)、Butyricimonas(丁酸弧菌属)和Gastranaerophilales相对丰度显著上升(P0.05),Ruminococcaceae_UCG-005(瘤胃菌属_UCG-005)和Ruminococcaceae_UCG-004(瘤胃菌属_UCG-004)相对丰度显著下降(P0.05),表明肺纤维化小鼠体内发生了一定程度的肠道菌群失调。而给药组(除g_Rumi nococcaceae_UCG-005外)可不同程度的改善以上肠道菌群在模型组中的相对丰度。说明黄芪花对肺纤维化小鼠的肺部保护作用可能通过纠正菌群紊乱,进而影响体内免疫平衡达到防治肺纤维化的作用。基于与代谢组学相关性分析,阐明了肠道菌与潜在生物标记物之间的关系,为临床诊断、医学治疗和病理生理学研究提供支持。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284.1
【部分图文】：

黄芪不同器官中初生代谢和次生代谢成分进行分析与评价，阐明各中的分布、组成及含量，并且明确黄芪花区别于其他器官中的化学基础上，采用体内外生物活性评价模型对黄芪花中资源化利用研究。图１－３－１。??塞＇古黄戾（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ?ｍｅｍｈｒｕｍｉｃｅｕｓ？、批？?ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ）花??

图２－１－２黄芪花脂肪酸类化学成分分析ＧＣ－ＭＳ总离子流图??（Ａ．混合对照品溶液；Ｂ．黄芪花样品溶液）??１．肉豆蔻酸；２．棕榈酸；３．油酸；４．硬脂酸；５．亚油酸；６．亚麻酸；７．花生酸；８．山嵛酸???２－１－２?Ｔｏｔａｌ?ｉｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ?ｏｆ?ｆａｔｔｙ?ａｃｉｄｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｆｌｏｗｅｒｓ?ｏｆ?Ｆａｔｔｙ?ａｃｉｄ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ?ｂｙ?ＭＳ?（Ａ．?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ；?Ｂ．?Ｓａｍｐｌｅ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ）??Ｋ？ｒ?１?ｌ？Ｏｒ?Ｉ?２?Ｗ〇ｒ?？?３??？?ｍ?ｆｔ?ａ＞?Ｐ??ｔｉ?１：?１：??１?Ｊ．ｌ??１???２ＷＪ?２７．０?２７．２?２７＾４?２７．６?Ｚ７．８?Ｊ＆４?３Ｓ．６?．％８?３＆．０?％２?５＆４?３＆６?４１８?４＾０?４Ｓ２?４Ｓ．４?４Ｒ．６?４Ｓ．８??產ｍ??４＊ｉ４?４Ｓ６?４Ｓ．８?４６．０?４＆２?４＆４?４Ｓ４?－？．６?４＆８?４＆０?４＆２?４＆４?４＆６?４＆６?４７．１）?＾７．２?４７．４?４７．６?４７＾??油ｆ?纟?７?棚ｆ?（ｉ?８?，?ＩＳ??８０?ｊ＼?？：?Ａｓ?＊：??

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本文编号：2844613