动脉粥样硬化(AS)是发生于动脉血管壁的慢性炎症性疾病。细胞焦亡是新近发现并被证实的一种新型促炎症性程序性细胞死亡方式,细胞焦亡发生的同时伴随着白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)等炎症因子的大量成熟与释放,并诱发炎症级联反应。研究表明,巨噬细胞焦亡在AS易损斑块的形成、破裂及免疫炎症反应中扮演着重要角色。NLRP3炎症小体是介导细胞焦亡的重要调节器,调控NLRP3炎症小体介导的巨噬细胞焦亡有望成为稳定AS易损斑块的新策略。清心解瘀方由国医大师陈可冀院士治疗心肌梗死的经验方愈梗通瘀汤精简化裁而来,具有益气活血、化浊解毒之功效,是针对冠心病“瘀毒”病因病机的代表方。临床研究表明清心解瘀方可降低稳定性冠心病患者的心血管终点事件和血清炎症因子水平,网络药理学研究提示抗炎是其主要作用机制之一,蛋白质组学研究显示清心解瘀方可调控AS相关细胞的程序性死亡。然而,清心解瘀方在分子水平是否可通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用?在细胞水平对焦亡这一促炎症性程序性细胞死亡方式是否具有调控作用?在动物水平抗炎、稳定AS易损斑块的效应机制如何?上述科学问题均有待深入探索和回答。基于此,我们提出如下科学假说:清心解瘀方可通过抑制NLRP3炎症小体的活化、调控巨噬细胞焦亡的发生、减少炎症因子IL-1β和IL-18的释放,从而发挥抗炎、稳定AS易损斑块的作用。围绕上述假说,分别开展体内实验、体外实验和网络药理学研究三部分研究内容,观察清心解瘀方对AS易损斑块的干预效应,探讨干预效应与巨噬细胞焦亡和NLRP3炎症小体活化之间的关系,旨在从整体动物、细胞分子和生物网络三个水平阐明清心解瘀方调控巨噬细胞焦亡、稳定AS易损斑块的效应特点与作用机制。研究一清心解瘀方对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块的影响及机制研究目的:观察清心解瘀方对ApoE-/-小鼠AS易损斑块的影响,从NLRP3炎症小体介导的巨噬细胞焦亡角度探讨其作用机制。方法:50只高脂饲料饲养的ApoE-/-小鼠随机分为模型组、阳性对照组(阿托伐他汀,5mg/Kg/d)、清心解瘀方低剂量组(4.7g/Kg/d)、清心解瘀方中剂量组(9.4g/Kg/d)和清心解瘀方高剂量组(18.8 g/Kg/d),10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组;灌胃给予相应药物8周;采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等血脂指标水平;采用苏丹Ⅳ大体染色、主动脉根部苏木素-伊红(HE)染色和Movat染色等病理形态学方法评估AS病变程度及斑块稳定性;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清C-反应蛋白(CRP)、IL-1β和IL-18等炎症因子水平;采用免疫组织化学法和蛋白质免疫印迹法(WB)检测焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表达水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qPCR)检测焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD mRNA表达水平。结果:血脂检测显示,与模型组比较,阿托伐他汀组、清心解瘀方低剂量、中剂量和高剂量组TC水平均显著降低(P0.05),与模型组比较,阿托伐他汀组、清心解瘀方中剂量和高剂量组LDL-C水平均显著降低(P0.05);苏丹Ⅳ大体染色显示,模型组主动脉斑块最为明显,阿托伐他汀组、清心解瘀方低剂量、中剂量和高剂量斑块均有不同程度的减轻;HE染色显示,与模型组比较,阿托伐他汀组、清心解瘀方中剂量和高剂量组主动脉根部斑块比例均显著降低(P0.05),阿托伐他汀组、清心解瘀方低剂量、中剂量和高剂量组斑块内脂质含量均显著降低(P0.05);Movat染色显示,与模型组比较,阿托伐他汀组和清心解瘀方高剂量组泡沫细胞含量均显著降低(P0.05),阿托伐他汀组和清心解瘀方高剂量组胶原纤维含量均显著升高(P0.05);ELISA实验显示,与模型组比较,阿托伐他汀组、清心解瘀方中剂量和高剂量组血清CRP、IL-1β、IL-18水平均显著降低(P0.05);免疫组织化学和WB实验显示,与模型组比较,阿托伐他汀组、清心解瘀方中剂量和高剂量组NLRP3蛋白表达量均显著降低(P0.05),阿托伐他汀组和清心解瘀方高剂量组Caspase-1蛋白表达量均显著降低(P0.05),阿托伐他汀组和清心解瘀方高剂量组GSDMD-N蛋白表达量均显著降低(P0.05);qPCR实验显示,与模型组比较,阿托伐他汀组和清心解瘀方高剂量组NLRP3mRNA表达量均显著降低(P0.05),阿托伐他汀组、清心解瘀方中剂量组和高剂量组Caspase-1mRNA表达量均显著降低(P0.05),阿托伐他汀组和清心解瘀方高剂量组GSDMD mRNA表达量均显著降低(P0.05)。结论:清心解瘀方可降低ApoE-/-小鼠血脂和血清炎症因子水平,改善机体脂质代谢和炎症反应,减少主动脉斑块内巨噬细胞浸润和脂质沉积,改善斑块局部炎症微环境,从而稳定AS易损斑块,其机制可能与调控主动脉组织中NLRP3炎症小体活化介导的巨噬细胞焦亡和炎症级联反应有关。研究二清心解瘀方对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响及机制研究目的:观察清心解瘀方含药血清对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响,从NLRP3炎症小体途径探讨其作用机制。方法:采用脂多糖(LPS)和三磷酸腺苷(ATP)联合刺激的J774A.1巨噬细胞为焦亡细胞模型,分为模型组、阳性对照组(MCC950,50μM)和清心解瘀方组(8%清心解瘀方含药血清),常规培养的J774A.1巨噬细胞作为空白对照组,给予相应药物干预24h;采用Hoechst33342/碘化丙锭(PI)双染、吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双染、PI和7-氨基放线菌素D(7-AAD)分别标记的流式细胞术检测J774A.1巨噬细胞焦亡水平;采用ELISA法检测IL-11β和IL-18等炎症因子水平;采用免疫荧光法和WB法检测焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表达水平;采用qPCR法检测焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1和GSDMD mRNA表达水平。结果:Hoechst33342/PI双染显示,与模型组比较,MCC950组和清心解瘀方组PI阳性率均显著降低(P0.05);AO/EB双染显示,与模型组比较,MCC950组和清心解瘀方组EB阳性率均显著降低(P0.05);PI流式细胞术显示,与模型组比较,MCC 950组和清心解瘀方组PI阳性率均显著降低(P0.05);7-AAD流式细胞术显示,与模型组比较,MCC950组和清心解瘀方组7-AAD阳性率均显著降低(P0.05);ELISA实验显示,与模型组比较,MCC950组和清心解瘀方组IL-1β水平均显著降低;免疫荧光和WB实验显示,与模型组比较,MCC950组和清心解瘀方组NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N蛋白表达量均显著降低(P0.05);qPCR实验显示,与模型组比较,MCC 950组和清心解瘀方组NLRP3、Caspase-1和GSDMD mRNA表达量均显著降低(P0.05)。结论:清心解瘀方含药血清可调控LPS和ATP联合诱导的J774A.1巨噬细胞焦亡,其机制与抑制NLRP3炎症小体活化有关。研究三清心解瘀方抑制NLRP3炎症小体活化的网络药理学研究目的:应用网络药理学方法探索清心解瘀方抑制NLRP3炎症小体活化的效应特点和潜在生物学机制,为未来深入研究提供依据。方法:采用GEO数据库公开发表的基因芯片信息筛选NLRP3炎症小体活化的相关基因,采用BATMAN-TCM数据库筛选清心解瘀方药物活性成分及靶基因信息,采用Cytoscape3.2.1软件和STRING数据库构建并分析清心解瘀方抑制NLRP3炎症小体活化的“药物-成分-靶基因”网络,采用FunRich3.1.3软件进行靶基因功能富集分析。结果:清心解瘀方中的115种活性成分可通过作用于64个靶基因抑制NLRP3炎症小体活化,其中来源于丹参和川芎的丹参新醌丙、丹参醌乙、γ-谷甾醇、丹参新酮Ⅰ、新隐丹参酮Ⅱ、次丹参醌、去氢丹参新酮、雌三醇等为主要药效成分;靶基因功能富集分析显示,清心解瘀方可通过调控能量通路、代谢、免疫反应、脂肪酸代谢等10余个生物学过程,IL-1信号通路、IL-12信号通路、TNF信号通路、IFN-γ信号通路、AP-1信号通路、mTOR信号通路、ARF6信号通路、PI3K/Akt信号通路等20余条生物信号通路发挥抑制NLRP3炎症小体活化的作用。结论:清心解瘀方抑制NLRP3炎症小体活化具有多成分、多靶点、多途径整合调节的效应特点,未来可从不同生物信号通路与NLRP3炎症小体的相互作用角度进一步探索清心解瘀方调控巨噬细胞焦亡的效应机制。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：
??ＧＳＤＭＤ蛋白在非经典和经典细胞焦亡途径中的具体分子机制见图１。??Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ?Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?Ｃａｎｏｎｉｃａｌ?Ｉｎｆｌａ巾ｍａｓｏｍｅｓ??．＇、Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ?〇?°?＾?Ｔｏｘｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ??ｂａｃｔｅｒｉａ?ＡＴＰ，?Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ?Ｓ．?Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ?ｄｓＤＮＡ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ??，?ｉ?ｏｆ?Ｒｈｏ?ＧＴＰａｓｅｓ??Ｓ?ｉ?ｉ?ｉ?Ｉ??￥?ＮＬＲＰ３?会?ＮＬＲＰ３?ＮＬＲＣ４?！?ＡＩＭ２?Ｐｙｒｉｎ??ｆ?［ｆｒ—?Ａ?Ａ?Ａ?ｎ??ｉ—ｉ?Ｌ＊ａ?Ｉ?１￣￣？?ｑ?＾￣Ｉ?１??Ｃａｓｐａｓｅ－４，５，１１?Ａｃｔｉｖｅ?Ｃａｓｐａｓｅ－１?Ａｃｔｉｖｅ?Ｃａｓｐａｓｅ－１??｜ｒ?｜ｆ?＾＾??Ｉ?ｌ?Ｉ?＼?Ｉ?＼?Ｉ?１??ＣＪＯ?ｃ＾」?０?０?ＣＵＤ?ｏ?ｏ??Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ?Ｄ?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ?Ｐｒｏ－ＩＬ－１３?ＵＰ?Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ?Ｄ?Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ?Ｐｒｏ－ＩＬ－１３?ＩＬ－１３??ｉ?，?）?ｌ?＿—Ｉ??Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ?Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ??〇?〇?〇?〇??〇?〇??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｒｏｌｅ?ｏｆ?ＧＳＤＭＤ?ｉｎ?ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ?ａｎｄ?ｃａｎｏｎｉｃａｌ?ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅｓ．??图１?ＧＳＤＭＤ在非经典和经典细胞焦亡途径中的分子机制??［引自?ＣｅＺ／ｒｅｒｅａｒｃ／！
激活ＮＬＲＰ３，?ＮＬＲＰ３进一步募集ＡＳＣ和ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１装配形成具有活性的ＮＬＲＰ３炎??症小体，活化的Ｃａｓｐａｓｅ－１进而催化加工ｐｒｏ－ＩＬ－ｉｐ和ＧＳＤＭＤ蛋白，诱导ＩＬ－ｌｐ的成熟、??释放及细胞焦亡的发生（图１）?［３０］。??■?Ｉ??Ｐｒｉｍｉｎｇ?１?ＮＬＲＰ３?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?１?Ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ?＆??ＩＬ－１ｐ?ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ??１?ｉ??ＰＡＭＰｓ?？?！??＆?广?／?１?？?ｒ?，??ＤＡＭＰ１－?｜?Ａ?？?？?１??ｉ?＾?ｒ?＇Ｘ?；；；Ｖ??、ＮＬＲＰ３?＊?ｌ??Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?．??Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｒｏｌｅ?ｏｆ?ＮＬＲＰ３?ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ＩＬ－１?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．??图１?ＮＬＲＰ３炎症小体／ＩＬ－】Ｐ信号通路在ＡＳ中的机制??［引自?ＣＶｒｃｗ／ａｒｔ洲?ｒｅｓｅａｒｃ／ｚ，?２０１８，?１２２（１２）：?１７２２－１７４０．］??在体动物基因编辑技术进？步验证了?ＮＬＲＰ３炎症小体／ＩＬ－ｉｐ信号通路ｂ?ＡＳ的关??系，沉默ＡｐｏＥ＿ｚ？小鼠的ＮＬＲＰ３基闵可减少ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８的分泌，降低斑块中巨噬细??胞和脂质含量，增加平滑肌细胞和胶原含量，提高斑块稳定性［３ｌｉ；沉默ＡｐｏＥ７－小鼠的??Ｃａｓｐａｓｅ－１基因可减少ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－６和ＴＮＦ－ａ等炎症因子的表达，显著减少主动??脉全程和主动脉根部
对ＡＳ易损斑块的干预效应，探讨干预效应与巨噬细胞焦亡和ＮＬＲＰ３炎症小体活化之??间的关系，旨在从整体动物、细胞分子和生物网络三个水平阐明清心解瘀方调控巨噬细??胞焦亡、稳定ＡＳ易损斑块的效应特点及抗炎和免疫调节机制（图１）。??３５??
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本文编号：
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