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发布时间：2020-10-17 23:29

　　 目的建立溃疡性结肠炎相关结肠癌(UCRCC)与NF-κB信号通路的网络模型,预测UCRCC的关键炎性靶标,明确葛根芩连汤及其指标成分组合物对这些靶标的影响。方法采用HPLC法,流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液,梯度洗脱,测定10种指标成分;检索Pubmed、ScienceDirect等数据库,分别查阅UCRCC疾病、NF-κB通路的上下游蛋白,采用Cytoscape软件,预测UCRCC的关键炎性靶标;在AOM/DSS诱导的UCRCC小鼠模型中,通过免疫组化、ELISA方法明确葛根芩连汤及其指标成分组合物对关键炎性靶标的影响。结果葛根芩连汤中葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的含量分别为1.677、0.154、0.159、0.045、0.448、0.035、0.095、0.013、0.111、0.006μg/g。交互网络中综合排名较高的前8位炎症因子分别是NF-κBp65、i NOS、COX-2、Bcl-2、TNF-α、IL-1β、ICAM-1和VCAM-1。与模型组比较,葛根芩连汤低、中、高剂量组及其指标成分组合物组、美沙拉秦肠溶片(5-ASA)组均显著下调UCRCC模型小鼠结肠组织中NF-κBp65、i NOS、Bcl-2、COX-2蛋白表达(P0.01),并显著降低血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1水平(P0.05、0.01)。结论葛根芩连汤及其指标成分组合物能够改善UCRCC小鼠结肠组织病理情况,并下调炎性因子的表达,对UCRCC具有一定的干预作用,为确定葛根芩连汤质量标志物(Q-marker)奠定了基础。
【部分图文】：

(2）精密度试验：精密量取混合对照品溶液，连续进样5次测定，记录色谱图。结果表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为0.75%、0.62%、1.10%、1.03%、1.05%、0.98%、0.67%、0.92%、1.08%、1.25%。(3）稳定性试验：精密量取混合对照品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样，记录色谱图。结果表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值分别为0.78%、0.98%、1.36%、1.08%、0.96%、0.88%、1.02%、1.13%、0.10%、0.85%。

通过Pubmed、Science Direct、Web of Science、CNKI等关键数据库，分别查阅UCRCC疾病、NF-κB通路的上下游蛋白，采用Cytoscape软件分别将NF-κB与UCRCC的上下游蛋白作为起点和终点，所建立NF-κB通路与UCRCC的交互作用网络如图2所示，依据Betweenness和Degree两项指标，推测NF-κB与UCRCC交互作用的关键蛋白，其中综合排名较高的前8位炎症因子分别是核因子-p65(NF-κBp65）、诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、环氧化酶-2(COX-2）、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、细胞间黏附分子-1(ICAM-1）和血管内皮细胞黏附分子1(VCAM-1）。以此为依据，后续实验将对以上8项指标进行测定。2.3 葛根芩连汤对关键炎症因子的影响

将小鼠结肠组织置于4%多聚甲醛中固定，后续脱水、包埋和切片，加兔抗抗体（按1∶100稀释），4℃恒温过夜后，37℃下滴加二抗孵育30 min。PBS冲洗3次，每次3 min，用滤纸去除多余水分，配制新鲜AEC显色，于光学显微镜下观察。结果如图4和表3所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠组织中NF-κBp65、i NOS、Bcl-2、COX-2蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，葛根芩连汤低、中、高剂量组、指标成分组合物组以及5-ASA组NF-κBp65、i NOS、Bcl-2、COX-2蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。3 讨论
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