枣原花青素提取纯化及抗氧化性研究

发布时间：2020-10-18 13:25

　　 枣是我国的主要果树之一,为促使地方的枣果资源及枣树种质资源的利用。本实验以湖南省衡阳地区多个枣品种果实为研究原料,以枣原花青素含量为主要指标对不同枣品种原花青素含量测定,对枣原花青素进行提取纯化与活性测定研究,其主要研究结果如下:(1)以湖南省衡阳地区14个枣品种为原材料,通过铁盐催化比色法对不同品种枣果实原花青素含量测定。结果表明,不同品种枣果实原花青素的含量有较大差异,枣果中原花青素含量最高的品种是最低的3.61倍,含量较高的品种有祁东鸡蛋枣、衡南子弹头、衡南龙须枣、祁东算盘枣等,其中祁东鸡蛋枣鲜果中原花青素含量高达6.86mg/g。(2)以单因素为基础,采用Box-Behnken实验设计和响应面法优化枣原花青素超声波提取工艺,得到了最佳参数:超声时间16 min、超声功率为618 W、超声温度为65℃、料液比为1:21,枣原花青素提取得率可以达到1.82%。(3)通过比较六种树脂的物理构造、吸附和解析等要素,以AB-8树脂为对象进行纯化工艺摸索。通过静态和动态试验,获得纯化的最佳参数为:上样液pH值5.0、上样量1.5 BV、2.5 BV 60%的乙醇洗脱剂,得枣原花青素纯化物干粉含量达73.07%。通过测定还原力、DPPH及羟基自由基清除能力等三种抗氧化指标,结果表明,枣原花青素纯化物还原力、DPPH及羟基自由基清除能力都要高于Vc,且其对DPPH清除能力强于对羟基自由基(4)利用乙酸乙酯和聚酰胺对枣原花青素纯化物进行分级分离,并比较了各丙酮洗脱产物的抗氧化能力,结果表明,乙酸乙酯和聚酰胺可实现对枣原花青素纯化物分级分离的目,获得30%、50%、70%丙酮洗脱产物,经测定其平均聚合度分别为:2.07、3.26、3.47,聚合度随洗脱剂丙酮的浓度而不断增大;不同聚合度原花青素的抗氧化能力有较大的区别,二聚体(D1)抗氧化能力要好于单体(儿茶素);随着聚合度不断增大,抗氧化能力逐步减弱;同聚合度的抗氧化能力呈浓度剂量依赖。(5)利用枣原花青素纯化物保护人类永生化角质HaCaT细胞,加以过氧化氢(H_2O_2)作用于HaCaT细胞诱导其氧化损伤,通过测定细胞凋亡、ROS水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性等指标,探讨枣原花青素纯化物对氧化损伤的HaCaT细胞的保护作用。结果表明,H_2O_2作用于HaCaT细胞会使其氧化损伤和细胞凋亡,而枣原花青素纯化物可以通过提高细胞内GSH-Px、SOD活性,减少HaCaT细胞中ROS含量和降低细胞凋亡率,保护细胞免受氧化应激的损伤。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284.2;R285
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1 枣的相关概况
        1.1 枣的概述
        1.2 枣的主要功能成分
            1.2.1 糖类化合物
            1.2.2 酚类化合物
            1.2.3 三萜类化合物
            1.2.4 环核苷酸
        1.3 枣的开发与利用
    2 原花青素的研究进展
        2.1 原花青素的概述
            2.1.1 原花青素的来源
            2.1.2 原花青素的结构
        2.2 原花青素素测定
            2.2.1 铁盐催化比色法
            2.2.2 香草醛法
            2.2.3 紫外分光光度法
            2.2.4 钼酸铵分光光度法
        2.3 原花青素提取
            2.3.1 溶剂提取法
2 萃取法'>            2.3.2 超临界CO₂ 萃取法
            2.3.4 超声波辅助提取法
            2.3.5 微波辅助提取法
        2.4 原花青素的分离纯化
            2.4.1 柱层析法
            2.4.2 有机溶剂萃取法
            2.4.3 薄层层析法
            2.4.4 膜分离法
        2.5 原花青素的生物活性
            2.5.1 清除自由基、抗氧化
            2.5.2 预防高血压、保护心血管
            2.5.3 抗衰老作用
            2.5.4 抗肿瘤作用
            2.5.5 皮肤保健、美容作用
    3 研究的目的和主要内容
        3.1 研究的目的及意义
        3.2 研究的主要内容
            3.2.1 不同品种枣果原花青素含量分析及检测方法的优化
            3.2.2 枣原花青素提取工艺研究及优化
            3.2.3 枣原花青素的纯化及抗氧化活性的研究
            3.2.4 枣原花青素的聚合度与抗氧化活性关系的研究
            3.2.5 枣原花青素对Hacat细胞的抗氧化作用研究
第二章 不同品种枣中原花青素含量测定分析
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 仪器与设备
        1.3 实验方法
            1.3.1 原花青素供试品溶液的制备
            1.3.2 铁盐催化比色法测定原花青素含量方法优化
            1.3.3 原花青素含量的计算
            1.3.4 不同品种枣原花青素含量的差异比较
    2 结果与分析
        2.1 原花青素含量测定方法的确定
            2.1.1 线性关系考察结果
            2.1.2 精密度试验结果
            2.1.3 稳定性试验结果与分析
            2.1.4 加标回收率试验结果与分析
        2.2 不同品种枣原花青素含量的差异分析
    3 小结与讨论
第三章 响应面法优化超声波提取枣原花青素工艺的研究
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 仪器与设备
        1.3 实验方法
            1.3.1 供试样的制备
            1.3.2 枣原花青素的超声提取单因素实验设计
            1.3.3 响应面法优化超声提取工艺
            1.3.4 原花青素的测定
        1.4 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 单因素实验结果与分析
            2.1.1 超声时间对枣原花青素得率的影响
            2.1.2 超声功率对枣原花青素得率的影响
            2.1.3 提取温度对枣原花青素得率的影响
            2.1.4 料液比对枣原花青素得率的影响
            2.1.5 乙醇浓度对枣原花青素得率的影响
            2.1.6 提取次数对枣原花青素得率的影响
        2.2 响应面分析实验设计及结果
            2.2.1 回归模型的建立
            2.2.2 回归方程及方差分析
            2.2.3 响应面交互作用分析
            2.2.4 验证实验
    3 小结与结论
第四章 大孔吸附树脂纯化枣原花青素及抗氧化性研究
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 仪器与设备
        1.3 试验方法
            1.3.1 大孔吸附树脂的预处理
            1.3.2 供试溶液的制备
            1.3.3 树脂的筛选
            1.3.4 AB-8 树脂的静态吸附与解析实验
            1.3.5 动态吸附和解析实验
            1.3.6 枣原花青素含量的测定
            1.3.7 枣原花青素纯化物的抗氧化能力研究
    2 结果与分析
        2.1 静态吸附实验
            2.1.1 树脂筛选
            2.1.2 静态吸附动力学曲线
            2.1.3 pH对吸附效果的影响
            2.1.4 不同浓度洗脱液解析效果的测定
        2.2 动态吸附实验
            2.2.1 上样量对树脂吸附效果的影响
            2.2.2 洗脱剂用量对树脂解析率的影响
            2.2.3 洗脱液pH的确定
        2.3 枣原花青素粗提物的纯化
        2.4 枣原花青素体外抗氧化活性研究
            2.4.1 枣原花青素纯化物对DPPH自由基清除能力的影响
            2.4.2 枣原花青素纯化物对羟基自由基清除能力的影响
            2.4.3 枣原花青素纯化物还原力的结果分析
    3 小结与讨论
第五章 枣原花青素聚合度与抗氧化活性关系的研究
    1 材料与方法
        1.1 材料和试剂
        1.2 仪器与设备
        1.3 实验方法
            1.3.1 原花青素平均聚合度的测定
            1.3.2 枣原花青素纯化物的萃取分级
            1.3.3 聚酰胺分离纯化乙酸乙酯相的低聚体原花青素
            1.3.3 不同聚合度枣原花青素抗氧化活性测定
    2 结果与分析
        2.1 原花青素平均聚合度测定的方法
            2.1.1 原花青素质量浓度标准曲线的建立
            2.1.2 原花青素物质的量浓度标准曲线的建立
        2.2 枣原花青素分级分离的平均聚合度分析
            2.2.1 乙酸乙酯萃取分离的平均聚合度分析
            2.2.2 聚酰胺分级分离的平均聚合度分析
        2.3 不同聚合度枣原花青素的抗氧化能力分析
            2.3.1 DPPH自由基清除能力的结果分析
            2.3.2 还原力的结果分析
    3 小结与讨论
第六章 枣原花青素对HaCaT细胞氧化损伤的保护作用研究
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 仪器与设备
        1.3 实验方法
            1.3.1 细胞培养与分组处理
            1.3.2 MTT检测细胞活性
            1.3.3 ROS的含量测定
            1.3.4 细胞凋亡检测
            1.3.5 SOD、GSH-Px酶活性测定
            1.3.6 统计学分析
    2 结果与分析
        2.1 枣原花青素纯化物对HaCaT细胞存活率的影响
2O₂损伤的HaCaT细胞活性的影响'>        2.2 枣原花青素纯化物对H₂O₂损伤的HaCaT细胞活性的影响
2O₂损伤的HaCaT细胞内ROS水平的影响'>        2.3 枣原花青素纯化物对H₂O₂损伤的HaCaT细胞内ROS水平的影响
2O₂诱导HaCaT细胞凋亡的影响'>        2.4 枣原花青素纯化物对H₂O₂诱导HaCaT细胞凋亡的影响
        2.5 SOD及 GSH-PX活性测定结果
    3 小结与讨论
全文结论与展望
    1 结论
    2 主要创新点
    3 展望
参考文献
符号说明
致谢
作者简介

【参考文献】

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