第一部分南蛇藤素对CYPs的诱导作用的研究目的南蛇藤素(celastrol)是中药雷公藤(Tripterygium Wilfordii.Hook.f.)等的主要活性成分之一,在临床上可能与其他药物联用治疗类风湿性关节炎等疾病。为探讨南蛇藤素是否可能与联用的药物发生基于药物代谢的药药相互作用(DDI),本研究考察了南蛇藤素对大鼠原代肝细胞内细胞色素P450(Cytochrome P450,CYPs)的表达调节作用。方法两步胶原酶灌注法提取Wistar大鼠原代肝细胞,培养12h后用南蛇藤素处理。采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测南蛇藤素处理后大鼠原代肝细胞内CYPs的mRNA的变化,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测蛋白的表达变化,采用LC/MS/MS检测S9体外代谢CYP2C、2D和3A的特异性底物生成4-羟基双氯芬酸、1-羟基丁呋洛尔和6β-羟基睾酮的速率变化来考察酶活性变化情况。数据采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。结果1、南蛇藤素能够明显诱导大鼠原代肝细胞内在药物代谢中发挥主要作用的CYP2C、CYP2D 和 CYP3A 家族成员的表达。CYP2C12,CYP2D2,CYP3A1 和 CYP3A9mRNA 的表达被显著诱导,而对CYP2C7和CYP2C11的mRNA水平无显著影响。该诱导作用也反映在蛋白水平的变化上。2、南蛇藤素作用于大鼠原代肝细胞后,CYP2C、CYP2D和CYP3A的酶活性也升高。结论南蛇藤素能够诱导大鼠原代肝细胞内在药物代谢中发挥主要作用的CYP2C、2D和3A的表达和酶活性。当与雷公藤制剂同服的药物受上述三个家族成员代谢时,可能会发生基于代谢酶诱导的DDI,导致同服药物的代谢清除加快并影响药效。第二部分南蛇藤素对CYPs诱导作用的调控机制研究目的南蛇藤素对大鼠原代肝细胞内多种CYPs有诱导作用,探讨南蛇藤素诱导CYPs的作用机制,可为南蛇藤素的合理使用提供理论依据。研究表明核受体PXR和CAR及转录因子p53和NF-κB能够调控CYPs的表达。因此,本研究将从核受体、p53和NF-κB三个方面入手,考察南蛇藤素对CYPs的诱导机制。方法两步胶原酶灌注法提取大鼠原代肝细胞,培养12h后用南蛇藤素处理,采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测南蛇藤素处理大鼠原代肝细胞后,核受体PXR和CAR的mRNA和蛋白表达情况进行分析,并对PXR和CAR下游基因P-gp mRNA的变化进行检测以分析上述核受体的功能。采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测p53、IκBα和NF-κB蛋白的表达情况,并结合特异性抑制剂考察受南蛇藤素影响的转录因子被抑制后,南蛇藤素对大鼠原代肝细胞内CYPs的mRNA诱导的变化情况。数据采用GraphPadPrism 5软件进行统计学分析。结果1、南蛇藤素作用后,大鼠原代肝细胞内CAR和PXR的mRNA和蛋白质并未被诱导,进一步对其活性进行分析发现其下游基因P-gp的mRNA发生了下调。该结果表明核受体CAR和PXR的活性可能被南蛇藤素抑制,提示上述核受体并未参与南蛇藤素对CYPs的诱导。2、南蛇藤素对p53的蛋白水平无显著影响。该结果表明南蛇藤素可能不通过p53诱导CYPs表达。3、南蛇藤素能够明显抑制NF-κB蛋白的表达,呈一定的剂量依赖性。南蛇藤素与NF-κB抑制剂共同处理大鼠原代肝细胞后,南蛇藤素对CYP2C12,CYP2D2和CYP3A1 mRNA的诱导作用受到了抑制。结论南蛇藤素对CYPs的诱导作用机制可能至少部分是通过下调转录因子NF-κB的表达,从而解除了 NF-κB对CYPs的抑制作用。核受体PXR和CAR以及转录因子p53可能在该过程中不发挥作用。第三部分南蛇藤素诱导CYPs在炎症中的作用目的CYP2C能将花生四烯酸(AA)转化为环氧二十碳三烯酸(EET),具有抗炎作用,而炎症中CYP2C下调。本研究前两部分研究结果表明南蛇藤素可诱导的CYP2C的活性。该结果提示南蛇藤素对CYP2C的诱导可能在其抗炎活性中发挥作用。因此,本部分拟考察南蛇藤素对CYPs的诱导作用是否参与了其抗炎机制。方法两步胶原酶灌注法提取大鼠原代肝细胞,培养12 h后药物处理。LPS处理大鼠原代肝细胞后,用SRB法检测细胞生存率的改变,结合ELISA法检测TNF-α和IFN-γ分泌的变化,考察炎症诱导情况。在CYPs联合南蛇藤素共同处理LPS诱导的大鼠原代肝细胞,ELISA法检测TNF-α和IFN-γ的分泌变化。结果1、5μg/mlLPS可在大鼠原代肝细胞水平诱导炎症反应。2、在大鼠原代肝细胞中,南蛇藤素与CYPs抑制剂共同处理与南蛇藤素单独处理相比,LPS诱导的大鼠原代肝细胞中TNF-α和IFN-γ的分泌并无明显变化。该结果表明抑制南蛇藤素诱导的CYPs对南蛇藤素抗炎活性没有影响,提示南蛇藤素诱导的CYPs可能不参与南蛇藤素的抗炎活性。结论南蛇藤素诱导的CYPs可能不参与南蛇藤素的抗炎作用。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285
【部分图文】：
２２?扬州大学硕士学位论文???ＣＹＰｓ?的表达（图?１）：?ＣＹＰ２Ｃ１２?为?８．３８?和?２７．７０?（图?１Ａ），?ＣＹＰ２Ｄ２?为?１３．３８?和?３９．９７?（图??１?Ｂ），?ＣＹＰ３Ａ１?为?６．９３?和?５６．２０?（图?１?Ｃ）和?ＣＹＰ３Ａ９?为?２．７０?和?２．２３?（图?１?Ｄ）。??
图１南蛇藤素处理大鼠原代肝细胞４８?ｈ后，ＣＹＰ２Ｃ１２?（Ａ），?ＣＹＰ２Ｄ２?（Ｂ），?ＣＹＰ３Ａ１?（Ｃ）和ＣＹＰ３Ａ９?（Ｄ）??的?ｍＲＮＡ?水平变化的情况。ｎ?＝?３，?＊＊尸＜０．０１，?＊＊＊Ｐ＜０．００１?ｖｓ?ｃｏｎｔｒｌ?组。??但南蛇藤素对ＣＹＰ２Ｃ７和ＣＹＰ２Ｃ１１的ｍＲＮＡ水平均无显著影响（图２）。以上结果提??示南蛇藤素作用于大鼠原代肝细胞后，能够显著诱导细胞内的ＣＹＰ２Ｃ１２、２Ｄ２、３Ａ１和３Ａ９??ｍＲＮＡ的表达。??
而其它抗体识别大鼠ＣＹＰｓ的特异性较差，因此本部分仅对大鼠的ＣＹＰ３Ａ的表??达进行了分析。南蛇藤素处理大鼠原代肝细胞４８?ｈ后，裂解细胞提取总蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??结果如图３所示。南蛇藤素能够显著诱导ＣＹＰ３Ａ的表达，２．５?和５?ｎＭ浓度下的诱导??倍数分别为１．８６和１．４４。２．５?ｎＭ浓度下的诱导作用更强可能是因为南蛇藤素在５?｜ｉＭ的浓??度下有细胞毒作用，可能导致了胞内蛋白的降解。上述结果表明南蛇藤素对大鼠原代肝细??胞内ＣＹＰ３Ａ蛋白的表达有显著诱导作用，与其诱导ｍＲＮＡ的趋势一致。??Ｂ??２．５－１??Ｃｅｌ?ＯＥＸＡ?ｆＪ?Ｊ＿??ＭＭ?〇?２５?５?＿?１〇?！，，?憂丄?４??ＣＹＰ３Ａ?丨一１１０?＾?■??ｇａｐｄｈ?ｐｍａｐ?轉｜?ｈ?：?Ｂ??Ｉ．＿＿Ｉ??／?／?／，??Ｏ?。合。??图３南蛇藤素处理大鼠原代肝细胞４８ｈ后，ＣＹＰ３Ａ的蛋白水平变化（Ａ）和ＣＹＰ３Ａ蛋白条带灰度值??分析结果（Ｂ）。ｎ＝３，无ｔｓ．?＊Ｐ＜０．０５，＊＊尸＜０．０１ｖｓｃｅｌ〇ｎＭ?组。??
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本文编号：
2850270
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