基于NTCP介导的生脉方主要效应组分间的相互作用与配伍机制研究

发布时间：2020-10-21 15:00

　　 背景:生脉方,包括生脉散、生脉饮、生脉注射液等中药制剂,临床上广泛应用于慢性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、病毒性心肌炎等疾病的治疗。课题组前期研究发现,OATP1B1/1B3介导了生脉方中主要效应组分麦冬皂苷D与人参皂苷Rb1/Rd的相互作用。牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)也是一种非常重要的肝脏摄取转运体,可介导许多内源性和外源性物质的跨膜转运,在药物的吸收、分布、排泄过程中发挥重要作用,近年来基于NTCP介导的药物-药物间相互作用也引起广大学者的高度关注。目的:采用稳定表达NTCP的HEK293T细胞模型,深入研究生脉方主要效应组分对NTCP转运功能的影响及其基于NTCP介导的相互作用及其配伍机制,为生脉方的临床安全合理应用进一步提供实验依据。方法:1.建立牛磺胆酸钠(TCNa)、人参皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re、麦冬皂苷D、麦冬皂苷Dˊ、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙在HEK293T细胞中的LC-MS检测方法。2.考察梯度摄取时间和药物浓度对TCNa在NTCP-HEK293T细胞中摄取的影响,探索TCNa在NTCP-HEK293T细胞中的最佳摄取条件。3.考察生脉方主要效应部位及效应成分对NTCP-HEK293T细胞中TCNa的转运影响,通过Graphpad Prisms计算其各自的IC_(50)值,并探索其影响机制。4.考察生脉方主要效应组分在NTCP-HEK293T细胞中的摄取情况及其摄取动力学,计算相应的动力学参数V_(max)和K_m值。5.考察生脉方中主要复杂组分间经NTCP介导的相互作用,探索其可能的配伍机制。结果:1.本实验建立的TCNa、人参皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re、麦冬皂苷D、麦冬皂苷Dˊ、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子醇乙的LC-MS定量分析方法特异性、精密度和准确度均较好,符合相关要求。2.在NTCP-HEK293T细胞中,TCNa的酶动力学参数K_m与V_(max)分别为9.41±1.22μM和342.63±17.36 pmol/mg protein/min。3.生脉方主要效应部位人参总皂苷、麦冬总皂苷、麦冬总黄酮、五味子总木脂素对NTCP-HEK293T细胞中TCNa的摄取有明显的抑制作用,在50μM其抑制率分别为44%、29%、49%和43%;12种主要效应成分中仅有人参皂苷Rg1、麦冬皂苷Dˊ和五味子甲素对TCNa的摄取有明显的抑制作用,在100μM其抑制率分别为58%、73%和69%。其中麦冬皂苷Dˊ对NTCP抑制作用较强,其IC_(50)值为6.71±0.70μM,而人参皂苷Rg1和五味子甲素抑制效果相对较弱,IC_(50)值分别为50.49±4.24μM和45.80±3.10μM。人参皂苷Rg1和麦冬皂苷Dˊ可能是通过非竞争性抑制模式来抑制TCNa的摄取,其V_(max)值分别从357.90±19.68pmol/mg protein/min减少至267.13±16.78 pmol/mg protein/min及从357.90±19.68 pmol/mg protein/min减少至212.13±13.77 pmol/mg protein/min,而K_m值几乎不变。五味子甲素则可能通过混合型抑制模式来抑制TCNa的摄取,其K_m值从10.09±1.46μM增加至15.52±2.31μM而V_(max)值从357.90±19.68pmol/mg protein/min减少至308.86±21.89 pmol/mg protein/min。4.生脉方12种主要效应成分中仅有人参皂苷Re和五味子乙素可能是NTCP的底物,可以经NTCP摄取转运,其摄取动力学参数K_m(μM)分别为47.13±2.73和82.43±11.36,V_(max)(pmol/mg protein/min)分别18.61±1.49和32.62±2.65;且它们在NTCP-HEK293T细胞中的摄取可以被经典抑制剂环孢菌素A明显抑制。5.麦冬总皂苷、麦冬总黄酮、五味子总木脂素、人参皂苷Rg1、麦冬皂苷Dˊ和五味子甲素对人参皂苷Re在NTCP-HEK293T细胞中的摄取有明显的抑制作用,在50μM抑制率分别为78%、95%、96%、36%、58%和49%。人参总皂苷、麦冬总皂苷、麦冬总黄酮和麦冬皂苷Dˊ对五味子乙素在NTCP-HEK293T细胞中的摄取有明显的抑制作用,在50μM抑制率分别为42%、41%、43%和39%,而人参皂苷Rg1和五味子甲素则对五味子乙素在NTCP-HEK293T细胞中的摄取无影响。结论:1.生脉方中主要效应部位人参总皂苷、麦冬总皂苷、麦冬总黄酮、五味子总木脂素及其主要效应成分人参皂苷Rg1、麦冬皂苷Dˊ、五味子甲素可不同程度地抑制NTCP介导的TCNa的摄取,是NTCP潜在的抑制剂,可能与临床药物发生基于NTCP介导的相互作用。2.人参皂苷Re和五味子乙素是NTCP潜在的底物,它们经NTCP介导的转运可被经典抑制剂环孢菌素A所抑制。3.生脉方中麦冬总皂苷、麦冬总黄酮、五味子总木脂素、人参皂苷Rg1、麦冬皂苷Dˊ和五味子甲素对NTCP介导的人参皂苷Re的摄取有不同程度的抑制作用;人参总皂苷、麦冬总皂苷、麦冬总黄酮和麦冬皂苷Dˊ对NTCP介导的五味子乙素的摄取有不同程度的抑制作用;生脉方主要复杂组分间存在基于NTCP介导的相互作用及配伍机制。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R289.5
【文章目录】：
摘要
abstract
中英文缩略词表
第1章 引言
第2章 生脉方主要效应组分对NTCP转运功能的影响
    2.1 材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 主要药品与试剂
        2.1.3 主要仪器与设备
    2.2 方法
        2.2.1 主要工作液的配制
        2.2.2 细胞培养方法及生长曲线绘制
        2.2.3 药物对NTCP-HEK293T细胞毒性的测定
        2.2.4 细胞样品中蛋白的含量测定
        2.2.5 细胞样品中TCNa的浓度测定
        2.2.6 NTCP-HEK293T细胞中TCNa摄取条件的探索
        2.2.7 生脉方中主要效应组分对NTCP摄取TCNa的影响研究
        2.2.8 Rg1、OPDˊ和SchA对 NTCP摄取TCNa的抑制机制研究
        2.2.9 统计分析
    2.3 结果
        2.3.1 NTCP-HEK293T细胞培养与生长曲线
        2.3.2 药物对NTCP-HEK293T细胞毒性的评价结果
        2.3.3 细胞样品蛋白的含量测定结果
        2.3.4 细胞样品中TCNa浓度测定的方法学评价结果
        2.3.5 NTCP-HEK293T细胞中TCNa摄取条件评价结果
        2.3.6 生脉方中主要效应组分对NTCP摄取TCNa的影响研究
        2.3.7 Rg1、OPDˊ和SchA对 NTCP摄取TCNa的抑制机制
    2.4 讨论
第3章 生脉方主要效应组分经NTCP的摄取及其相互作用研究
    3.1 材料
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 主要药品与试剂
        3.1.3 主要仪器与设备
    3.2 方法
        3.2.1 主要工作液的配制
        3.2.2 NTCP-HEK293T细胞培养方法及其生长曲线的绘制
        3.2.3 药物对NTCP-HEK293T细胞毒性的测定
        3.2.4 细胞样品蛋白的含量测定
        3.2.5 生脉方中12 种效应成分在细胞样品中的浓度测定
        3.2.6 生脉方中主要效应成分经NTCP介导的摄取研究
        3.2.7 生脉方中主要效应组分间经NTCP介导的相互作用研究
        3.2.8 统计分析
    3.3 结果
        3.3.1 NTCP-HEK293T细胞培养与生长曲线
        3.3.2 药物对NTCP-HEK293T细胞毒性的评价结果
        3.3.3 生脉方12 种主要效应成分检测的方法学评价结果
        3.3.4 生脉方中主要效应成分经NTCP介导的摄取情况
        3.3.5 生脉方主要效应组分间经NTCP介导的相互作用
    3.4 讨论
第4章 结论与展望
    4.1 结论
    4.2 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
综述
    参考文献

【参考文献】

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本文编号：2850272