心脏重构是心脏对一系列生理性或病理性刺激的一种反应,是心功能衰竭的独立危险因素。探明心脏重构的病理生理学过程以减慢或逆转它的进程,已成为心衰治疗的新目标。心衰分为射血分数降低的心衰(HFr EF)或射血分数保留的心衰(HFp EF),后者在心衰群体中占比近50%。传统的逆转心脏重构的药物如RAAS抑制药、β受体阻断药等仅对部分HFr EF患者的心脏重构有效,对HFp EF患者的心脏重构疗效不佳。肥胖、糖尿病、心脏压力超负荷(如高血压、瓣膜病)通常发展为向心性肥厚,进而发展为HFp EF的风险性更大,深入探讨心脏重构的调控机制,寻找有效减慢或逆转HFp EF心脏重构的药物迫在眉睫。五甲基槲皮素(PMQ)在沙棘果实及山奈属植物的根茎中含量较高,是自然界中广泛存在的多甲氧基黄酮类化合物。试验数据显示PMQ具有多重药理学效应,如抗肾脏纤维化作用、抗糖尿病及改善机体代谢作用、改善大鼠压力超负荷及Ang II诱导的心脏重构等,但机制有待深入研究。本课题拟通过建立谷氨酸钠诱导的肥胖(MSG-IO)模型和胸主动脉缩窄(TAC)诱导的压力超负荷模型构建小鼠心脏重构模型,并利用异丙肾上腺素(ISO)诱导的乳鼠心肌细胞肥大模型,评价PMQ的抗心脏重构作用及机制,为寻找抗心脏重构的新靶点及药物提供理论支持。第一部分PMQ改善MSG-IO小鼠的代谢紊乱及心脏重构目的:观察MSG-IO小鼠的心脏重构及PMQ的心脏保护作用。方法:CD-1乳鼠出生第2 d起,皮下注射谷氨酸钠(MSG,3 mg/g),连续7 d,每天1次。正常对照组(Control)注射等量生理盐水。21 d后雌雄分笼饲养。选取雄性MSG-IO造模小鼠50只,随机分为MSG-IO模型组、PMQ给药组(5、10、20 mg/kg)和二甲双胍阳性对照组(Met,300 mg/kg)。从8周龄起,Met组饲以常规饲料,将Met溶于饮水中给药;PMQ组饲以相应浓度的含药饲料;除Met组外,其他组均常规饮水。18周龄时口服葡萄糖耐量试验,23周龄时测量心脏超声心动图,24周龄时测量各组小鼠的体重、腰围、体长,计算Lee指数,并检测血葡萄糖和胰岛素含量、计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。摘取心脏,Masson染色检测心肌纤维化程度。结果:(1)PMQ明显改善MSG-IO小鼠的代谢异常与Control组比,MSG-IO模型组小鼠呈现明显的肥胖型2型糖尿病特征,表现为肥胖体征如腰围、体重、Lee指数显著增加,糖耐量受损,空腹血糖、血清胰岛素水平、HOMA-IR均显著升高。PMQ(5、10、20 mg/kg)剂量依赖性地改善上述各指标。PMQ(20 mg/kg)的疗效与Met(300 mg/kg)相近。(2)PMQ明显改善MSG-IO小鼠的心脏重构与Control组比,MSG-IO小鼠的左室前壁(LVAW)和室间隔(IVS)厚度明显增厚、左室内径(LVID)稍有减小,呈向心性肥厚特征。心脏缩小僵硬、心肌纤维化明显。PMQ降低MSG-IO小鼠的心室壁厚度,包括收缩期和舒张期LVAW和IVS,并恢复LVID的大小;显著降低心脏重量指数和左心室重量指数,改善心室壁的僵硬度,并抑制心肌间质纤维化程度;PMQ对左室射血分数(EF)、左室缩短分数(FS)无明显影响。以上结果表明PMQ有效地抑制了肥胖型2型糖尿病模型心脏的向心性肥厚。PMQ(20 mg/kg)改善MSG-IO小鼠心脏重构的作用明显优于Met(300 mg/kg)。结论:PMQ显著改善MSG-IO小鼠的代谢紊乱和心脏向心性重构。第二部分PMQ改善TAC诱导小鼠压力超负荷心脏重构目的:观察TAC诱导的小鼠心脏重构变化及PMQ的抗重构作用。方法:C57BL/6小鼠适应性喂养1周后(8周龄,♂),进行TAC手术诱导小鼠心脏重构。TAC术后2周时超声心动图检测,与假手术组(sham)比,TAC小鼠LVAW、LVPW、IVS(包括收缩期和舒张期)均显著增加,LVID显著降低,确证TAC小鼠心脏出现典型的向心性肥厚。TAC小鼠随机被分为5组:TAC(无干预)、TAC+Vehicle(0.1%DMSO)、TAC+PMQ 5、10、20 mg/kg/d,灌胃给药,连续8周。TAC术后10周,超声心动图测量上述反映心室壁厚度和心功能的指标。宰杀后称量脏器重量并计算脏器重量指数。形态学观察心肌病理结构。Real-Time PCR测量心肌组织ANP、BNP、TGF-β1等心脏重构标志物的表达。结果:(1)与sham组比较,TAC术后10周,心室壁厚度显著增加,呈向心性肥厚特征。LVID、EF、FS与sham组相比无差异;心室壁僵硬,心脏重量指数和左心室重量指数显著增加;心肌结构紊乱,炎性细胞浸润明显,心肌纤维横断面积和纤维化程度显著增大;心肌重构标志物如ANP、BNP、TGF-β1等m RNA表达显著增高。TAC+Vehicle组各参数和指标与TAC组趋势同,相比均无差异。(2)与TAC+Vehicle组相比,PMQ各剂量组不同程度地抑制心室壁的增厚,显著降低心脏重量指数和左心室重量指数;改善心肌结构紊乱,降低心肌纤维横断面积和纤维化程度;显著降低心肌ANP、BNP、TGF-β1的m RNA表达。结论:PMQ治疗可显著改善TAC诱导的小鼠心脏重构。第三部分PMQ抗心脏重构的机制研究目的:探讨PMQ抗心脏重构的机制。方法:(1)MSG-IO模型和TAC模型:免疫组化法检测心肌组织氧化应激的标志物4-HNE和8-OHd G表达,免疫荧光染色检测Nrf2核转位情况。其余心肌组织提取总蛋白或浆/核蛋白,分子生物学方法检测抗氧化蛋白Sestrins及Nrf2/keap1通路蛋白的表达。(2)乳鼠心肌细胞肥大模型:分离培养大鼠新生乳鼠心肌细胞,ISO(10μM,24h)诱导细胞肥大模型,观察不同浓度PMQ(1,3,10μM)抗心肌细胞肥大作用。行α-Actinin染色及Real-Time PCR检测ANP、BNP、β-MHC等肥大标志物;Western blot检测抗氧化蛋白Sestrins及Nrf2/keap1通路蛋白的表达,比较组间差异。采用Si RNA有效沉默Sestrin2,同样方法检测上述指标的变化,以确定Sestrin2是否为介导PMQ抗心脏重构的关键靶点。结果:(1)MSG-IO模型:与MSG-IO模型组相比,PMQ可显著增加Sestrin 1/2、HO-1蛋白的表达,降低keap1蛋白的表达,并促进Nrf2的核转位。(2)TAC模型:(1)与sham组比较,TAC组心肌4-HNE和8-OHd G表达均明显升高,Sestrin2、Nrf2和HO-1蛋白表达减少,keap1蛋白表达显著升高,且TAC+Vehicle组和TAC组相比无差异。(2)与TAC+Vehicle组相比,PMQ纠正Sestrin2、Nrf2/keap1及HO-1蛋白的表达异常。(3)乳鼠心肌细胞肥大模型:ISO刺激诱导的乳鼠心肌细胞肥大模型,Sestrin2、Nrf2、HO-1蛋白表达明显下降,而keap1蛋白表达增高。不同浓度的PMQ干预可逆转ISO引起的这些改变,与整体动物实验结果相吻合。Si RNA有效沉默乳鼠心肌细胞Sestrin2后,PMQ抗心肌细胞肥大作用及调控Nrf2/keap1信号通路的作用显著减弱。结论:PMQ抗心脏重构的作用至少是部分Sestrin2依赖性的;PMQ抗心脏重构作用与上调Sestrin2,进而增强Nrf2/keap1内源性抗氧化系统功能有关。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：英文缩略词表
摘要
Abstract
前言
第一部分 五甲基槲皮素改善MSG-IO小鼠的代谢紊乱及心脏重构
一、材料及方法
二、实验结果
三、讨论
第二部分 五甲基槲皮素改善TAC诱导的小鼠压力超负荷心脏重构
一、材料及方法
二、实验结果
三、讨论
第三部分 五甲基槲皮素抗心脏重构的机制研究
一、材料及方法
二、实验结果
三、讨论
参考文献
全文总结及创新点
综述
References
攻读博士学位期间发表的论文
致谢
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