黄芪药渣中半纤维素多糖的提取纯化、结构解析及抗肿瘤、抗菌膜活性物质的筛选

发布时间：2020-10-22 14:15

　　选题依据:黄芪,是我国非常重要的大宗药材之一。根据估算,每年我国使用的黄芪药材达到了10万吨,因此每年会有数万吨黄芪药渣产生。当前,对药渣的再利用都集中应用于制成各种食用菌的底料、制成肥料、动物饲料等。但是这些衍生产品的附加值比较低,在生产过程中甚至会造成环境的二次污染。中药药渣主要由细胞壁的成分组成,现代研究发现一些植物细胞壁的组分(半纤维素、果胶)中含有许多具有不同生物活性的多糖成分,因此被称为未被开发的“药物资源库”。周素梅等发现麦麸细胞壁半纤维素中的阿拉伯木聚糖的抗肿瘤活性比较高。本课题组前期发现黄芪药渣中的半纤维素主要含有阿拉伯糖和木糖等单糖,推测该多糖组分可能具有抗肿瘤等生物活性。因此,从黄芪药渣中开发具有抗肿瘤等生物活性的多糖产品,对于实现黄芪资源的充分利用具有重大意义。目的:提取纯化黄芪药渣中的半纤维素,解析其结构,并评价其体外抗氧化活性、抗人肺腺癌细胞的活性以及抗菌膜活性。为黄芪药渣中具有生物活性的多糖的开发利用提供理论基础。研究方法与研究内容:通过分级提取法从黄芪药渣中提取半纤维素,运用离子交换层析、凝胶过滤层析对提取的药渣半纤维素进行了分离纯化。运用凝胶色谱法测定药渣半纤维素的相对分子质量,采用GC-MS法测定其单糖组成,通过甲基化方法确定单糖之间的连接位点,并结合IR、NMR分析其结构。体外抗氧化活性评价包括羟自由基、超氧自由基、DPPH清除实验。评价了黄芪药渣半纤维素对人肺腺癌细胞A549细胞和人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞的增殖抑制作用。建立了体外菌膜模型并用于筛选抗菌膜活性物质。评价了黄芪药渣半纤维素、微生物代谢产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌膜的破坏作用。研究结果:1、从黄芪药渣中提取纯化获得了4个半纤维素组分,分别记为AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4。2、研究了4个半纤维素组分的化学结构,发现AX-I-1含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩尔比为0.006:14.113:8.284:0.116:0.468:1,通过甲基化分析确定其主链中含有阿拉伯糖和木糖,并通过β-(1→2),(1→3),(1→4)糖苷键组成,支链由(1→4)βArap,(1→3)βGalp,(1→2)βMan组成,非还原末端由αRhap,βGclp,βGalp组成。发现AX-I-2中含有阿拉伯糖、木糖,其摩尔比为11.2:8.9。AX-I-2中单糖残基的连接方式为:→4)-D-Xylp-(1→、→4)-D-Arap-(1→。AX-I-3中含有阿拉伯糖、木糖、葡萄糖,通过计算得到其摩尔比为10.4:79.3:1.1。AX-I-3中单糖残基的连接方式为:→2,3,4)β-D-Xylp(1→、→4)β-D-Arap(1→、→5)β-D-Glcp(1→。AX-I-4中含有阿拉伯糖、木糖、葡萄糖,通过计算得到其摩尔比为12.6:76.1:2.4。AX-I-4中单糖残基的连接方式为:→2,3,4)β-D-Xylp(1→、→4)β-D-Arap(1→、→5)β-D-Glcp(1→。3、当浓度在0.1~0.5 mg/mL之间时,4种半纤维素对羟自由基的清除率在5%左右。AX-I-1对超氧自由基的体外清除率在10%左右,AX-I-2,AX-I-3对超氧自由基的体外清除率在30%左右,AX-I-4对超氧自由基的体外清除率在40%左右。当多糖浓度在0.1~0.5 mg/mL之间时,AX-I-2,AX-I-3和AX-I-4对DPPH的体外清除率在30%左右。AX-I-1对DPPH的体外清除率在5%左右。4、当AX-I-1的浓度为1 mg/mL时,AX-I-1对A549细胞有杀伤作用,给药后其细胞活力在70%左右。在该浓度下AX-I-1对BEAS-2B细胞也有较强的杀伤作用。当AX-I-3的浓度在100~1000μg/mL之间时,AX-I-3对A549细胞有较强的杀伤作用。当AX-I-3的浓度为1 mg/mL时,给药后其细胞活力在50%左右。当AX-I-4的浓度在200~1000μg/mL之间时,AX-I-4对A549细胞有杀伤作用,给药后其细胞活力在80%左右。5、AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌菌膜均无破坏作用。大肠杆菌、绿脓杆菌和乳杆菌L1/L5/L7的代谢产物对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌菌膜均具有显著的破坏作用。并发现大肠杆菌代谢产物中抗菌膜活性成分是蛋白质,该蛋白质通过下调金黄色葡萄球菌菌膜形成相关基因的转录从而发挥抗菌膜作用。大肠杆菌、绿脓杆菌和乳杆菌L1/L5/L7的代谢产物对白色念珠菌的生长无显著性影响。大肠杆菌和绿脓杆菌的代谢产物对金葡菌的生长有一定的影响,乳杆菌L1/L5/L7的代谢产物完全抑制其生长。结论:从黄芪药渣中提取纯化获得了4个半纤维素组分。采用HPLC凝胶色谱法、GC-MS单糖组成分析、GC-MS甲基化分析、IR和NMR解析了AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4的结构。评价了4种半纤维素组分的抗氧化活性,并评价4种半纤维素组分的抗肿瘤、抗菌膜活性。结果表明AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3和AX-I-4均有一定的体外抗氧化活性。AX-I-3对A549细胞有较强的杀伤作用,同时也能杀伤BEAS-2B细胞,有一定的细胞毒性。AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3和AX-I-4均无抗白色念珠菌、金黄色葡萄球菌菌膜活性。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

半纤维素,多糖,多糖含量,黄芪

第三章黄芪药渣半纤维素的提取纯化以 lgMw为纵轴，作图，得到标曲，并计算得到线性方程。糖 AX-I-1、AX-I-2、AX-I-3、AX-I-4 分别配制成浓度为 2 mg得的 tR带入方程即可计算得到其相对分子质量。结果药渣半纤维素多糖 AX-I 的纯度和得率中提取得到的黄芪药渣半纤维素多糖 AX-I 为淡黄色粉末，粗素多糖含量为 78.1%，经 Sevage 法除蛋白后多糖含量 92.3%。age 法除蛋白质条件优化该实验探讨得出用 Sevage 法除药渣粗多糖中的蛋白质需要的 3.1 可知，Sevage 法除蛋白质重复 4 次后，蛋白质残留量仅有量仍有较大的增加，因此得出 Sevage 法脱除药渣多糖中蛋白为 4 次。

黄芪,半纤维素,阴离子交换层析,DEAE-纤维素