芹菜素对小鼠胚肝细胞诱导肝癌细胞SMMC-7721分化的促进作用

发布时间：2020-10-23 15:30

　　 目的:肝癌是在肝细胞或肝内胆管上皮细胞病变引起的肝脏恶性肿瘤,其中肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占90%以上,HCC发病率位列全球第五位,我国是HCC发病率最高的国家,目前HCC的死亡率位列癌症相关死因第三位。即使在发达国家HCC的5年内相对生存率也不到5%,因此,找到可以根除HCC的方法亟待解决。由于现有治疗HCC的方法均不理想,所以我们提出了一种新的思路。异常的微环境是肿瘤发生的决定因素,异常的微环境使组织干细胞接收到的调节增殖及分化的信号失调:分化异常下调或停滞及增殖信号明显上调进而形成肿瘤细胞。研究表明,癌症干细胞(Cancer stem cells,CSCs)和正常干细胞之间存在着许多相似之处,基于CSCs与正常干细胞的相似之处,导师齐锦生教授认为CSCs是停滞于某发育阶段,而呈无限增殖的“正常干细胞”或细胞的“返祖”现象。据此,我们认为胚胎细胞具有诱导肿瘤细胞分化的能力,这种诱导分化的能力具有组织、时间和空间特异性,并且没有种属差异。我们的前期研究已经表明,用13.5d的胚肝细胞与肝癌细胞株HepG2共培养,可以诱导HepG2细胞分化,并揭露了其相关的分子机制。本研究选取12.5d的小鼠胚肝细胞对SMMC-7721细胞进行诱导分化。近年来,关于祖国传统医学及中草药(The traditional Chinese medicine,TCM)的研究表明,TCM用于肿瘤的治疗具有预防肿瘤发生,减毒、提高治疗效果,减少肿瘤复发和转移三大优势。其中许多应用于肿瘤治疗的中药如密蒙花、半枝莲等中均含有芹菜素(Apigenin,API)。API作为一种黄酮类的抗癌药物,在其高剂量时可诱导肿瘤细胞凋亡,而低剂量是可诱导肿瘤细胞分化。因此,本研究选取低剂量API作为肝癌细胞株SMMC-7721的一种分化的诱导剂和促进剂,旨在探讨低剂量API能否诱导SMMC-7721细胞分化以及能否促进胚肝细胞诱导SMMC-7721细胞分化。本实验在前期实验基础上,用梯度浓度API干预肝癌细胞株SMMC-7721细胞株,筛选出诱导SMMC-7721分化的API适宜浓度,然后利用该浓度的API与小鼠胚肝细胞共培养共同干预SMMC-7721细胞,对比API与小鼠胚肝细胞共培养分别单独作用于SMMC-7721细胞的差异。用免疫荧光技术,检测SMMC-7721细胞中AFP与HNF-4α蛋白表达水平变化;用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)技术,检测afp与hnf-4α的mRNA表达水平,通过2~(-ΔΔCt)法计算差异;利用免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测AFP、HNF-4α蛋白水平的表达。本研究选取SMMC-7721细胞株为研究对象,探索天然植物提取物API对共培养诱导分化肿瘤细胞的促进作用,为临床低毒高效的根除HCC提供新的思路。方法:1细胞培养1.1 SMMC-7721细胞:SMMC-7721细胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培养基培养,0.25%的胰蛋白酶消化传代,接种于100mL培养瓶中,在37℃、5%CO_2培养箱中培养。1.2原代胚肝细胞分离及培养:采用Ⅳ胶原酶消化法,从孕鼠腹中取得胎鼠,分离出胚肝,将胚肝组织剪成组织块,Ⅳ胶原酶消化胚肝组织块,成功分离为单个胚肝细胞;多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞,纯化胚肝细胞;高糖DMEM培养胚肝细胞。2实验设计与分组2.1用梯度浓度API诱导肝癌细胞SMMC-7721分化72h,实验分为6组:con组,API 2.5μm/L、API 5μm/L、API 7.5μm/L、API 10μm/L、API12.5μm/L。2.2胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API的培养基共培养,分别进行24h与48h。其中小鼠胎肝与SMMC-7721细胞的共培养体系建立为:利用带有“transwell”小室的六孔板建立小鼠胚肝细胞与SMMC-7721细胞的非接触式共培养体系。实验分为4组:第:1组为con组;第2组为用诱导SMMC-7721分化能力最强,浓度为5μm/L的API组;第3组为小鼠胚肝细胞与SMMC-7721共培养的co-culture组;第4组为5μm/L的API与小鼠胚肝细胞共同作用于SMMC-7721的co-culture+API组。4组各进行24h与48h后对比差异。3 API诱导SMMC-7721分化的最适浓度API诱导SMMC-7721分化过程中,不同浓度API对SMMC-7721的分化诱导能力是不同的。3.1利用荧光显微镜观察AFP与HNF-4α的分泌量。3.2 Trizol一步法提取SMMC-7721细胞中总RNA,用β-actin做内参,real-time PCR方法检测afp和hnf-4α的mRNA表达,计算afp和hnf-4α的抑制率。4胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API的培养基共培养24h。4.1利用荧光显微镜观察AFP与HNF-4α的分泌量。4.2 Trizol一步法提取SMMC-7721细胞中总RNA,用β-actin做内参,real-time PCR方法检测afp和hnf-4α的mRNA表达,计算afp和hnf-4α的抑制率。4.3与HNF4α蛋白的分泌,计算afp和hnf-4α的抑制率。5胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API的培养基共培养48h。5.1光镜下观察未经处理的SMMC-7721与co-culture+API组中SMMC-7721细胞形态有何差异。5.2利用荧光显微镜观察AFP与HNF-4α的分泌量。5.3 Trizol一步法提取SMMC-7721细胞中总RNA,用β-actin做内参,real-time PCR方法检测afp和hnf-4α的mRNA表达,计算afp和hnf-4α的抑制率。5.4收集细胞,提取细胞总蛋白,用GAPDH做内参,用WB法检测AFP与HNF4α蛋白的分泌,计算AFP和HNF-4α的抑制率。结果:1原代胚肝细胞的分离纯化及培养采用Ⅳ型胶原酶消化法,首先将胚肝组织剪成组织块,Ⅳ胶原酶消化胚肝组织块,成功分离为单个胚肝细胞;多次重复差速贴壁法除去成纤维细胞,纯化胚肝细胞;高糖DMEM培养胚肝细胞,原代胚肝细胞培养成功。2免疫荧光法检测梯度浓度API诱导SMMC-7721细胞72h后,SMMC-7721细胞内AFP蛋白与HNF-4α蛋白水平的变化。与con组相比,可明显观察到5μm/L的API对SMMC-7721诱导分化能力最强,其AFP蛋白水平明显降低,其HNF4α蛋白水平明显上升。3 real-time PCR检测梯度浓度API诱导SMMC-7721细胞72h后,SMMC-7721细胞内afp与hnf-4αmRNA表达水平的变化。SMMC-7721细胞经梯度浓度API处理后,检测SMMC-7721细胞中afp与hnf-4αmRNA的相对表达量,与con组比,2.5μm/L组、5μm/L组、7.5μm/L组、10μm/L组、12.5μm/L组中各组afp mRNA均有下调,其中5μm/L组效果显著;各组hnf-4αmRNA均有上调,其中5μm/L组效果显著,与免疫荧光结果一致。4免疫荧光检测胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API(5μm/L)的培养基共培养24h后,SMMC-7721细胞内AFP蛋白与HNF-4α蛋白水平的变化。与con组相比,可观擦到,API组中AFP蛋白水平无明显变化,co-culture组中AFP蛋白水平略有下降,co-culture+API组中AFP蛋白水平也略有下降,其水平为各组中最低;API组中HNF-4α蛋白水平略有上升,co-culture组中HNF-4α蛋白水平略有上升,但低于API组,co-culture+API组中HNF-4α蛋白水平也略有上升,其水平为各组中最高。5 real-time PCR检测胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API(5μm/L)的培养基共培养24h后,SMMC-7721细胞内afp与hnf-4αmRNA表达水平的变化。SMMC-7721细胞与12.5d胚肝细胞加入5μm/L API共培养后,检测SMMC-7721细胞中afp mRNA的相对表达量,与con组比,API组、co-culture组、co-culture+API组中各组afp mRNA均有下调,其中co-culture+API组效果显著;除API组hnf-4αmRNA未明显变化,其余组均有上调,其中co-culture+API组效果显著。6 WB法检测胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API(5μm/L)的培养基共培养24h后,SMMC-7721细胞内AFP蛋白与HNF-4α蛋白水平的变化。SMMC-7721细胞与12.5d胚肝细胞加入5μm/L API共培养后,检测SMMC-7721细胞中AFP蛋白的相对表达量,与con组比,API组、co-culture组、co-culture+API组中各组AFP蛋白相对表达量均有下调,其中co-culture+API组效果显著;各组HNF-4α蛋白相对表达量均有上调,其中co-culture+API组效果显著,且与免疫荧光及real-time PCR结果一致。7光镜下观察co-culture+API组中SMMC-7721细胞形态,与正常con组相比,12.5d的胚肝细胞与肝癌细胞SMMC-7721细胞共培养,并加入含5μm/L API培养基,培养48h后SMMC-7721细胞生长明显受到抑制,且部分细胞回缩、变圆,最终崩解;另有一部分细胞未变化,而继续培养也不会增殖。8免疫荧光法检测胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API(5μm/L)的培养基共培养48h后,SMMC-7721细胞内AFP蛋白与HNF-4α蛋白水平的变化。与con组相比,可观擦到,API组中AFP蛋白水平略有下降,co-culture组中AFP蛋白水平明显下降,co-culture+API组中AFP蛋白水平显著下降,且其水平为各组中最低;API组中HNF-4α蛋白水平明显上升,co-culture组中HNF-4α蛋白水平明显上升,但略低于API组,co-culture+API组中HNF-4α蛋白水平显著上升,且其水平为各组中最高。9 real-time PCR检测胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API(5μm/L)的培养基共培养48h后,SMMC-7721细胞内afp与hnf-4αmRNA表达水平的变化。SMMC-7721细胞与12.5d胚肝细胞加入5μm/L API共培养后,检测SMMC-7721细胞中afp mRNA的相对表达量,与con组比,API组、co-culture组、co-culture+API组中各组afp mRNA均有下调,其中co-culture+API组效果显著;各组hnf-4αmRNA均有上调,其中co-culture+API组效果显著。10 WB法检测胎肝细胞与SMMC-7721细胞用含API(5μm/L)的培养基共培养48h后,SMMC-7721细胞内AFP蛋白与HNF-4α蛋白水平的变化。SMMC-7721细胞与12.5d胚肝细胞加入5μm/L API共培养后,检测SMMC-7721细胞中AFP蛋白的相对表达量,与con组比,API组、co-culture组、co-culture+API组中各组AFP蛋白的相对表达量均有下调,其中co-culture+API组效果显著;API组、co-culture组、co-culture+API组中各组HNF-4α蛋白的相对表达量均有上调,其中co-culture+API组效果显著,且与免疫荧光及real-time PCR结果一致。而经对比co-culture+API组,48h比24h效果更加显著。结论:1.低浓度API(5μm/L)可诱导肝癌细胞SMMC-7721分化;2,特定时间(12.5d)的小鼠胚肝细胞可诱导肝癌细胞SMMC-7721分化;3.API可促进小鼠胚肝细胞与SMMC-7721共培养时对SMMC-7721的诱导分化作用,且48h协同作用达到峰值。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

36图 2 免疫荧光检测梯度浓度芹菜素处理 SMMC-7721 细胞 72h 后 AFHNF-4α蛋白变化情况Fig.2 Immunofluorescence Detection ofAFP and HNF-4α Protein ChangSMMC-7721 CellsAfter 72-hour Treatment with Gradient ConcentratiApigeninA: Immunofluorescence Detection of AFP Protein Changes in GraConcentration API-treated SMMC-7721 Cells. B: ImmunofluoresDetection of HNF-4α Protein Changes in Gradient Concentration API-trSMMC-7721 Cells.

图 3 real-time PCR 检测梯度浓度芹菜素处理 SMMC-7721 细胞 72h 后 afp与 hnf-4α基因的表达情况Fig.3 Real-time PCR detection of afp and hnf-4α gene expression inSMMC-7721 cells treated with gradient concentration apigenin for 72 hoursA: The total RNA of SMMC-7721 Note: Total RNA of SMMC-7721 usingTrizol kit and the procedures were according to the manufacturer’sinstructions. Extracted RNA with an optical density OD260/OD280 ratiogreater than 1.8 was used for cDNA synthesis. B: The expression of afpmRNA in SMMC-7721 cells treated with real-time PCR. C: The expression ofhnf-4α mRNA in SMMC-7721 cells treated with real-time PCR.(*P <0.05compared with control group ; **P <0.01, compared with control group. )

图 4 免疫荧光检测共培养处理 SMMC-7721 细胞 24h 后 AFP 与 HNF-4α蛋白变化情况Fig.4 Immunofluorescence Detection ofAFP and HNF-4α Protein Changes inCo-cultured SMMC-7721 CellsAfter 24 HoursA: Immunofluorescence detection of AFP proteins in mouse embryonic livercells inducing differentiation of SMMC-7721 cells. B: Immunofluorescencedetection of HNF-4α proteins in mouse embryonic liver cells inducingdifferentiation of SMMC-7721 cells.
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 Christiana Hadjimichael;Konstantina Chanoumidou;Natalia Papadopoulou;Panagiota Arampatzi;Joseph Papamatheakis;Androniki Kretsovali;;Common stemness regulators of embryonic and cancer stem cells[J];World Journal of Stem Cells;2015年09期

2 黄再超;;芹菜素对肺癌细胞的抗肿瘤作用以及增敏作用分析[J];世界最新医学信息文摘;2015年78期

3 黄佳颖;杨悦;李玉荣;王星;;芹菜素的研究进展[J];江苏科技信息;2015年04期

4 辛丽丽;张旭;龚婕宁;;芹菜素抗癌机制研究进展[J];中国实验方剂学杂志;2013年21期

5 吴唐维;宁勇;陈卫群;卢忠心;;微RNA参与中药抗肿瘤作用的研究进展[J];重庆医学;2013年13期

6 Xuchen Cao;Bowen Liu;Wenfeng Cao;Weiran Zhang;Fei Zhang;Hongmeng Zhao;Ran Meng;Lin Zhang;Ruifang Niu;Xishan Hao;Bin Zhang;;Autophagy inhibition enhances apigenin-induced apoptosis in human breast cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年02期

7 赵国欣;赵明;刘艳丽;李领川;王立萍;冯冲;;基于电化学方法的抗癌中草药密蒙花中芹菜素的研究[J];安徽农业科学;2012年09期

8 龙泳伶;龙雪梅;;中医治则指导下抗肿瘤中药的临床分类[J];中国中医药现代远程教育;2011年12期

9 黄海英;;抗肿瘤中药研究现状[J];实用中医药杂志;2011年05期

10 文红波;曹运长;董晓英;许金华;曹建国;;芹菜素诱导人肝癌Hep G2细胞分化[J];湖南师范大学学报(医学版);2007年03期

相关硕士学位论文 前1条

1 刘欢;芹菜素抗非小细胞肺癌作用及协同增敏顺铂抗肺癌作用机制初步研究[D];广东药科大学;2017年

本文编号：2853211