第一部分 在脑缺血/再灌注大鼠模型冰片配伍黄芪甲苷与三七总皂苷促进药物成分入脑的研究目的:探讨在脑缺血再灌注大鼠模型,冰片是否可以促进黄芪甲苷(AST IV)和三七总皂苷(PNS)配伍时主要有效成分透过血脑屏障进入脑组织。方法:采用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,将大鼠随机分为模型组、单用冰片组、单用AST IV组、单用PNS组、AST IV+PNS配伍组、冰片+AST IV+PNS配伍组,以液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)测定患侧与健侧大脑皮层、小脑中AST IV和PNS有效成分(Rg1、Rb1、R1)的含量。结果:AST IV无论是单用还是与PNS、冰片配伍,其口服后主要分布在大脑皮层,尤其是患侧大脑皮层。冰片配伍AST IV+PNS后能使患侧与健侧大脑皮层中AST IV含量显著增加。PNS单用,其有效成分Rg1、Rb1、R1主要分布在患侧小脑。冰片与AST IV+PNS合用后,能使患侧皮层中Rb1含量显著增加,使健侧和患侧大脑皮层中Rg1含量增加,使大脑皮层尤其是患侧大脑皮层及小脑中R1含量增加。结论:大鼠脑缺血再灌注后,AST IV与PNS的有效成分人参皂苷Rb1、Rg1及R1在皮层和小脑均有一定的分布。AST IV单用时,AST IV主要分布在大脑皮层;PNS单用时,有效成分Rb1、Rg1及R1主要分布在小脑。冰片与AST IV、PNS合用后,能促进AST IV、Rb1、Rg1及R1向大脑皮层的富集,尤其是向缺血再灌注侧大脑皮层的富集;而且,能不同程度地促进AST IV、Rb1、Rg1及R1在大脑皮层和小脑的吸收,尤其是患侧大脑皮层的吸收。第二部分 冰片配伍黄芪甲苷与三七总皂苷对脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的影响目的:探讨冰片、黄芪甲苷(ASTⅣ)和三七总皂苷(PNS)配伍对脑缺血再灌注后血脑屏障(BBB)通透性的影响和作用机制。方法:采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,灌胃给药冰片、ASTⅣ、PNS及其配伍药物,改良Longa法观察神经功能缺损症状,干湿重法测定脑组织含水量,镧示踪电镜技术反映BBB通透性,免疫组化法和Western-blot法检测脑组织闭锁小带蛋白1(zonula cccludens-1,ZO-1)、ZO-2、咬合蛋白(Occludin)及闭合蛋白5(Claudin-5)表达。结果:1、脑缺血再灌注后,大鼠出现神经功能缺损症状,神经功能评分显著增加。各药物组能显著降低神经功能评分,且冰片+AST IV+PNS组的效应强于各药物单用及ASTⅣ+PNS组。2、脑含水量测定显示,脑缺血再灌注后,脑含水量显著增加。各药物能显著降低脑含水量,且ASTⅣ+PNS配伍的效应强于ASTⅣ与PNS单用,冰片+AST IV+PNS的效应强于各药物单用及ASTⅣ+PNS配伍。3、镧示踪电镜结果显示,在正常脑组织,硝酸镧颗粒呈连续线性分布在毛细血管内壁,BBB正常;脑缺血再灌注后,BBB紧密连接破坏,镧颗粒从毛细血管漏出,脑组织水肿明显并失去正常形态结构。各药物均能不同程度减轻上述病理改变,缓解BBB结构受损,镧颗粒漏出减少,脑水肿和脑组织受损程度减轻,尤以冰片+AST IV+PNS效应更加明显。4、免疫组化和Western-blot检测结果表明,脑缺血再灌注后,ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-5蛋白表达显著减少。各药物可使ZO-1蛋白表达显著增加;除AST IV外,各药物显著上调Occludin蛋白表达,冰片+AST IV+PNS还能显著上调ZO-2蛋白表达;且AST IV+PNS上调ZO-1、Occludin的效应强于AST IV、PNS单用,冰片+AST IV+PNS上调ZO-1、ZO-2、Occludin的效应强于各药物单用及ASTIV+PNS。结论:冰片促进AST IV及PNS有效成分进入脑组织的作用不但不是通过增强BBB通透性、开放BBB来实现,而且冰片、AST IV和PNS还能不同程度降低脑缺血再灌注后BBB通透性,减轻脑水肿,对抗脑组织损伤,三种药物合用可增强效应,其机制可能与协同抑制脑缺血后紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin蛋白表达的下调,从而保护BBB有关。第三部分 冰片配伍黄芪甲苷与三七总皂苷对脑缺血再灌注后血脑屏障转运蛋白的影响目的:从血脑屏障(BBB)转运蛋白调节探讨冰片配伍黄芪甲苷(ASTⅣ)和三七总皂苷(PNS)对脑缺血再灌注后促进药物成分入脑和抗脑损伤的作用。方法:采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,灌胃给药冰片、ASTⅣ、PNS及其配伍药物,2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法测定脑组织损伤,Western-blot法检测脑组织外排蛋白P-糖蛋白(P-gp)和多药耐药蛋白(MRP)-1、2、4、5及摄取蛋白有机阳离子转运体3(OCT-3)、有机阴离子转运多肽2(OATP-2)蛋白的表达,Real-time PCR法检测脑组织多药耐药(MDR)基因mdr1a、mdr1b和mrp-1、mrp-2、mrp-4、mrp-5m RNA含量。结果:1、TTC染色显示,脑缺血再灌注后,脑组织出现明显梗死灶。各药物能显著减少脑梗死体积,ASTⅣ+PNS配伍的效应强于ASTⅣ与PNS单用,冰片+AST IV+PNS的效应强于各药物单用及ASTⅣ+PNS配伍。2、对主要外排蛋白和相应基因检测结果表明,脑缺血再灌注后,P-gp、MRP-1、MRP-2、MRP-4、MRP-5蛋白表达均显著增多。冰片能显著下调P-gp、MRP-2、MRP-4蛋白表达,PNS能显著下调MRP-4、MRP-5蛋白水平,AST IV、AST IV+PNS与冰片+AST IV+PNS能显著下调P-gp、MRP-2、MRP-4、MRP-5蛋白表达,且冰片+AST IV+PNS的效应显著强于各药物单用及AST IV+PNS,AST IV+PNS的效应显著强于AST IV或PNS单用。相应基因表达结果也与蛋白表达结果类似。3、对脑组织主要摄取蛋白OCT-3、OATP-2蛋白表达检测表明,脑缺血再灌注后OCT-3蛋白表达在模型组及药物组变化均不明显,而模型组OATP-2蛋白显著降低。PNS、AST IV+PNS及冰片+AST IV+PNS能显著上调OATP-2蛋白表达,且AST IV+PNS的效应显著强于AST IV、PNS单用,冰片+AST IV+PNS的效应显著强于各药物单用及AST IV+PNS。结论:脑缺血再灌注后,脑组织损伤,BBB的主要外排蛋白和基因表达均显著增强,而摄取蛋白OATP-2表达显著减少。冰片配伍AST IV及PNS后,能增强抗缺血性脑损伤的作用,其作用可能与下调BBB中外排蛋白P-gp、MRP-2、MRP-4、MRP-5和相应基因表达,同时上调摄取蛋白OATP-2表达,促使脑组织中AST IV及PNS有效成分的吸收与富集,增强脑组织中药物浓度有关。
【学位单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
通过2.3.1处理空白脑组织，得到空白脑组织样本，在（1）条件下检测，Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留时间分别为3.52、6.01、3.18、6.38 min，且在Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留时间处均无明显色谱峰干扰（图1A、1B，图2A、2B），表明该分析方法具有很好的专属性。
对照品基质溶液中4种有效成分MRM离子对质谱图
通过2.3.1处理空白脑组织，得到空白脑组织样本，在（1）条件下检测，Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留时间分别为3.52、6.01、3.18、6.38 min，且在Rg1、Rb1、R1、AST IV的保留时间处均无明显色谱峰干扰（图1A、1B，图2A、2B），表明该分析方法具有很好的专属性。
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本文编号：
2853417
