益气逐瘀解毒颗粒调节Girdin表达治疗大鼠肝纤维化的作用机制研究

发布时间：2020-10-25 02:13

　　 目的研究益气逐瘀解毒颗粒调节Girdin表达治疗大鼠肝纤维化的作用机制。方法将123只SD雄性大鼠随机分成模型对照组和空白对照组,模型对照组予以CCL4、橄榄油混合液(2:3),皮下注射造模,7周后将模型组大鼠随机分成中药高、中、低剂量组,阳性对照组,模型对照组,原空白对照组不变。中药组即益气逐瘀解毒颗粒高、中、低三个剂量组,阳性对照组用扶正化瘀胶囊干预,模型对照组和空白对照组等体积蒸馏水灌胃,5周后处死大鼠,取肝脏、血清标本,进行相关指标检测:(1)采用HE、MASSON染色法检测肝组织损伤及肝纤维化病理指标;(2)ELISA法检测血清HA、LN表达水平;(3)生化实验法检测血清肝功指标ALT、AST、γ-GT水平;(4)RT-PCR法检测肝纤维化相关因子MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、Col1A1、Col1A2的表达;(5)RT-PCR法检测肝纤维化相关通路中关键因子PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3、PKA、CREB的表达;(6)RT-PCR法、Western Blot、免疫组化法检测Girdin的表达(7)免疫组化法检测肝组织中α-SMA表达;结果1、CCL4造模结果(1)一般情况:除空白对照组外,模型对照组大鼠精神状态及饮食变化明显,大小便异常,注射药物部位皮肤溃烂,毛发脏乱、粗糙,脱落明显,有死亡情况。肝标本大体情况:造模结束可见肝标本萎缩,体积变小,色暗、无光泽,表面颗粒样凸起明显,质硬。(2)造模病理结果:肝纤维化形成,纤维间隔由中央静脉和汇管区向周围延伸,分割肝小叶,并有明显形成假小叶的趋势,肝纤维化分级达到3级或以上。2、益气逐瘀解毒颗粒治疗结果(1)一般情况:治疗组大鼠的精神状态良好、饮食可、皮毛及色泽较造模时有显著改善,皮下溃烂逐渐好转,大鼠体重均明显增加。(2)肝脏标本大体情况:益气逐瘀解毒颗粒各剂量组,肝脏色红,有光泽,表面光滑,无颗粒样凸起,质地均匀,边缘稍钝;阳性对照组少数肝脏色暗,无光泽,质较硬,萎缩、边缘钝;模型对照组大多数肝标本色暗,无光泽,萎缩,质硬,周围圆钝;空白对照组肝脏标本色鲜红,有光泽,质软,边缘锐利。(3)病理指标检测结果:益气逐瘀解毒颗粒各剂量组,胶原纤维含量与模型对照组比较明显减少,肝小叶结构清晰,纤维组织主要分布在汇管区、中央静脉及其周围,低剂量组部分病理切片可见形成较细条索状结构甚至向周围延伸;阳性对照组中仅有少数出现小叶结构被较粗的纤维间隔分割;模型对照组多数肝脏病理切片的肝小叶被较粗的纤维间隔分割;空白对照组仅少数胶原纤维分布于汇管区、中央静脉。MASSON染色半定量评分结果:益气逐瘀解毒颗粒高剂量组与模型对照组比较,评分显著降低(p0.01)。(4)生化指标检测结果:各组肝功均在正常范围。与空白对照组比较,模型对照组AST、ALT、γ-GT水平显著升高(p0.05);与模型对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒高剂量组AST、ALT、γ-GT的水平显著降低(p0.05);(5)ELISA法检测肝纤维化指标LN水平的结果:模型对照组与空白对照组比较,LN水平显著升高(p0.01);与模型对照组比较,各个药物干预组中均可见LN显著降低(p0.05);益气逐瘀解毒颗粒低剂量组与阳性对照组(扶正化瘀组)比较,LN含量显著下降(p0.05).(6)RT-PCR法检测大鼠肝组织中MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、Col1A1、Col1A2表达的结果:与空白对照组比较,模型对照组MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表达量显著下降(p0.05),TIMP-1、Col1A1、Col1A2表达显著升高(p0.05);与模型对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒高剂量组MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13表达量显著升高(p0.05),TIMP-1、Col1A1、Col1A2表达显著下降(p0.05);(7)RT-PCR法检测大鼠肝组织中Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3、PKA、CREB表达结果:(1)与空白对照组比较,模型对照组Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3的表达显著升高(p0.05),PKA、CREB的表达显著下降(p0.05);(2)与模型对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒高剂量组Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3表达显著下降(p0.05),PKA、CREB的表达显著显著升高(p0.05);(3)与阳性对照组比较,中药高剂量组Girdin、PI3K、AKT、FOXO1、TGF-β1、SMAD2、SMAD3表达显著下降(p0.05),PKA、CREB的表达显著显著升高(p0.05);(8)Western Blot、免疫组化法检测肝组织中Girdin的表达结果:(1)与空白对照组比较,模型对照组Girdin表达量显著升高(p0.01);(2)与模型对照组比较,中药高剂量组Girdin表达量显著下降(p0.05);(9)免疫组化法检测肝组织中α-SMA表达结果:(1)与空白对照组比较,模型对照组α-SMA表达量显著升高(p0.01);(2)与模型对照组比较,各个治疗组α-SMA表达量显著下降(p0.01);(3)与阳性对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒高、中剂量组α-SMA表达量显著下降(p0.05);(4)益气逐瘀解毒颗粒低剂量组与阳性对照组比较,无显著差异(p0.05);结论1、皮下注射CCL4成功构建肝纤维化大鼠模型;2、益气逐瘀解毒颗粒具有抗肝纤维化作用;3、益气逐瘀解毒颗粒能通过下调Girdin表达,使促纤维化信号通路受抑,最终起到治疗肝纤维化的作用;
【学位单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
缩略词及中英文全称
中文摘要
Abstract
前言
1、实验材料
    1.1 实验动物
    1.2 实验药物
    1.3 主要试剂
    1.4 主要试剂的配制
    1.5 实验仪器、器材
2、实验方法
    2.1 CCL4肝纤维化大鼠模型制备
    2.2 益气逐瘀解毒颗粒灌胃治疗
    2.3 大鼠一般情况及肝标本的大体观察
    2.4 标本收集
    2.5 指标检测
3、实验结果
    3.1 肝纤维化模型制备结果
    3.2 治疗期间观察
    3.3 益气逐瘀解毒颗粒治疗的结果
讨论
    1、益气逐瘀解毒颗粒的来源及药物组成
        1.1 益气逐瘀解毒颗粒的来源
        1.2 益气逐瘀解毒颗粒的方解
        1.3 益气逐瘀解毒颗粒的药物组成
    2、关于阳性药物选择依据
    3、模型制备方法的选择
    4、HE、MASSON染色及血清HA、LN、ALT、AST、γ-GT在肝纤维化诊疗中的意义
        4.1 HE、MASSON染色在肝纤维化诊断中的意义
        4.2 血清HA、LN在肝纤维化诊断中的意义
        4.3 ALT、AST、γ-GT在肝纤维化中的作用讨论
    5、肝纤维化发生机制探讨
        5.1 肝纤维化与α-SMA、TGF-β1 的相关性
        5.2 肝纤维化与MMPs、TIMPs的相关性
    6、肝纤维化与Girdin的相关性
        6.1 Girdin与HSCs的相关性
        6.2 Girdin对肝纤维化相关信号通路的调控
总结及展望
参考文献
致谢
附图
实验路线图
综述
    参考文献
在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

【参考文献】

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本文编号：2855305