甘青铁线莲活性成分APG的制备工艺与脑保护作用研究

发布时间：2020-10-25 04:46

　　研究背景铁线莲属(Clematis)植物属毛茛科(Ranunculaceae),在我国分布广泛,化学成分复杂,在民间主要用于风湿风寒、疼痛感染等疾病的治疗。甘青铁线莲(Clematis tangutica)为铁线莲属植物的一种,主要分布于我国西部地区,在藏医药中用于治疗活血通瘀和消化不良等病症。课题组前期对甘青铁线莲中的皂苷和黄酮类成分进行系统分离鉴定,并对得到的物质进行了活性筛选,发现其中一种黄酮苷成分—芹菜素-7-O-β-D-(-6''-p-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷(APG)具有明显的抗氧化活性。目前,关于APG心血管保护作用及机制的研究已经取得进展,关于其脑保护作用的研究正在推进,并已在动物实验中得到验证,具备进一步开发为治疗药物的可能性。本课题主要从提取和合成两个方面对APG的制备工艺进行优化和探索,并对合成产物的脑保护作用进行验证,为APG的生产和研究提供了一定理论和实验依据。方法1.响应面法优化超声提取甘青铁线莲总黄酮工艺:在乙醇体积分数、提取时间、液料比三个单因素实验的基础上,对总黄酮提取率建立Box-Behnken中心组合实验设计,模拟二次回归模型,通过响应面分析,对超声提取甘青铁线莲总黄酮工艺进行优化。2.化学合成活性成分APG:通过查阅文献和实验探索,设计了以芹菜素、乙酰溴代葡萄糖、香豆酸乙烯酯为起始原料的APG合成路线,并对催化剂、溶剂等反应条件进行了实验比较,在此基础上合成目标产物APG。3.合成产物的脑保护作用研究:建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型,分为假手术组、缺血模型组、溶剂组、阳性对照组(r-tPA)、产物干预组。通过观察实验大鼠的神经行为学评分及TTC染色脑梗死面积,对合成产物芹菜素-7-O-(-6''-p-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷的脑保护作用进行验证。结果1.响应面法优化超声提取甘青铁线莲总黄酮工艺:通过模型分析和可行性修正,发现乙醇体积分数对于总黄酮提取率影响最为显著,得到最佳提取条件为乙醇体积分数80%,提取时间44 min,液料比30.5:1,最大提取率可达1.266%。2.化学合成活性成分APG:通过比较实验,确定第三步反应采用Lipolase 100T脂肪酶作为催化剂、CH_3CN作为溶剂、反应时间为76h,采用黄酮特征反应、ESI-MS,结合~1H-NMR和~(13)C-NMR等理化数据验证合成结果,最终芹菜素-7-O-(-6''-p-香豆酰基)-吡喃葡萄糖苷合成产率为42.27%。3.合成产物的脑保护作用研究:与MCAO组相比,合成产物干预组大鼠神经行为学评分显著升高,脑梗死面积显著减少(P0.05),表明通过此合成路线得到的APG具有脑保护作用。结论本课题利用响应面、催化合成等方法分别从提取和合成两方面对于甘青铁线莲中活性成分APG的制备工艺进行了探索和优化,利用大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型验证了合成反应中产物的脑保护作用,对于APG的量化生产提供了实验依据,为甘青铁线莲的开发利用以及心脑血管新药进一步研发提供了理论和实验基础。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R284
【部分图文】：

三萜皂苷类,化合物结构,母核,化合物

中发现（70）。Zhao Mei[19]等从粗齿铁线莲（C. argentilucida）根部的正丁醇萃取部位中分离得到 1 个乌苏烷型三萜皂苷类化合物（68）和 1 个蒲公英赛烷型三萜皂苷类化合物（69），均为新化合物，化合物 68 的 20 位双键乌苏烷型苷元结构在铁线莲属植物中首次被发现，另有 4 个齐墩果烷型三萜皂苷类化合物（43-46）为首次从该属植物中发现。张倩[20]等从大叶铁线莲（C. heracleifolia）全草的正丁醇萃取部位中分离得到 4 个齐墩果烷型三萜皂苷类化合物，其中化合物 47 为首次从该属植物中发现。Zhao Min[21]等从甘青铁线莲（C. tangutica）全草甲醇提取物的正丁醇萃取部位中分离鉴定了 16 个齐墩果烷型三萜皂苷类化合物（9、10、12、48-60），其中化合物 48-55 为新化合物，且化合物 51-54 的 C23，28 位双糖链结构在铁线莲属植物中较为少见。卫柯[22]等从美花铁线莲（C. potaninii）地上部分正丁醇萃取部位中分离鉴定了 5 个齐墩果烷型三萜皂苷类化合物（8、61-64），均为首次从该种植物中分离得到，其中化合物 64 为首次从该属植物中发现。化合物结构见图 1 及表 1。

母核,黄酮类化合物,芹菜素,木犀草素

空军军医大学硕士学位论文黄酮类线莲属植物中的黄酮类成分主要以黄酮苷的形式存在，近年研究中发主要为芹菜素、木犀草素、山柰酚、槲皮素等。牛江进[16]等从甘青铁酯萃取部位中首次分离得到木犀草素（74）、芹菜素（71）。袁琳[23]等（C. connata）的正丁醇萃取部位中分离鉴定了 11 个黄酮苷类化合物， 4 个（76-79）、槲皮素类 2 个（80、81）、染料木素类 1 个（88、89），（85）、异牡荆素（86）和过山蕨素（87），均为首次在该种植物中分离4]等从甘青铁线莲（C. tangutica）全草的正丁醇萃取部位中分离鉴定了化合物，其中芹菜素类 2 个（72、73）、木犀草素类 1 个（75）、槲皮2、83）、异荭草素（85），其中化合物 73 为首次从铁线莲属植物中得到次在该种植物中分离得到。苏琨[25]等从大瓣铁线莲（C. macropetala）萃取部位中首次分离得到槲皮素-7-O-芸香苷（84）。化合物结构见图 2

母核,东北铁线莲,脂氧化酶,木脂素