以荭草苷为关键成分的组合药物设计及其抗MIRI机制研究

发布时间：2020-10-26 01:13

　　 目的传统中药物质成分复杂,质量难于控制,药效物质作用机制难以证明是目前中药国际化的重大难题。随着现代中药的发展进程,以“物质基础基本清楚”、“作用机制基本清楚”为原则的组分中药研究成为新的热点,并己初步建立了“标准组分、组效关系、组分配伍、优化设计”的组分中药研发模式。前期研究结果证实,荭草苷具有一定的抗心肌缺血缺氧/复氧损伤作用,本研究以荭草苷为关键成分进行组分设计,探寻“试验设计-建立模型-多目标优化”的组分优化方法,探究“以荭草苷为关键成分的组合药物比单个成分在心肌缺氧/复氧模型上的保护作用更好,且组合药物抗MIRI作用机制与调控自噬相关”的假说,为组分优化研究提供方法学上的参考及实验依据。方法与结果1.筛选进入组分优化的成分首先,研究前期对含荭草苷的植物的调研,通过约束成分筛选条件:①黄酮类成分;②与荭草苷共同存在在同一植物中;③有抗氧化、抗炎等相关药理作用研究报道。据此初步选出槲皮苷、牡荆素、槲皮素、木犀草素、异荭草素五个成分。第二步,采用CCK-8法检测各成分对H9c2细胞存活率的影响。第三步,采用三气培养箱混合气体法建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,通过CCK-8法和LDH法研究各成分对H9c2缺氧/复氧损伤细胞存活率、损伤率的影响。实验结果提示:荭草苷(0～200 μM),槲皮苷(0～200 μM),牡荆素(0～80μM),异荭草苷(0～200μM)孵育36 h内对H9c2细胞增殖无明显影响;除异荭草苷外,荭草苷、槲皮苷、牡荆素均能显著性下调细胞损伤率。因此,荭草苷(0～50μM)、槲皮苷(0～40μM)、牡荆素(0～24μM)为最适合后续均匀试验设计的组分及浓度范围。2.基于“UD-SR-SA”法的组分优化方法研究及其实验验证本实验通过均匀设计得到荭草苷、槲皮苷、牡荆素的不同配比组合,通过药效学实验分别进行检测:①利用CCK-8法检测各配比对H9c2缺氧/复氧损伤模型细胞存活率的影响;②采用LDH法检测细胞损伤率;③检测培养基中NO含量。基于上述药效学实验结果,利用R语言建立逐步回归模型,得到综合药效与荭草苷、槲皮苷、牡荆素给药剂量之间的三元二次方程式。基于模拟退火算法理论,用python编程解出当综合药效最佳时各成分的给药浓度,即最佳配比组合OQV-e。最后,对OQV-e进行药效学实验验证。结果发现:最佳配比组合能显著提高H9c2心肌细胞存活率,降低细胞损伤率,降低NO含量,且最佳配比组合比荭草苷、槲皮苷、牡荆素单个成分降低细胞损伤率效果更明显(P0.05),说明相较于单个成分,最佳配比组合表现出更优异的抗MIRI药效。3.OQV-e对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制探讨通过光镜下观察细胞形态发现,最佳配比组能明显改善受损的H9c2细胞状态。通过Western Blot法检测H9c2细胞内LC3、Beclin 1、p-JNK、JNK、的蛋白表达水平,评价最佳配比对缺氧/复氧损伤H9c2细胞内JNK通路及细胞自噬的影响。结果发现:与模型组相比,最佳配比组p-JNK/JNK的比值降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著性降低,Beclin 1的表达水平明显升高(P0.05),说明最佳配比组合能够抑制JNK信号通路,抑制过度自噬,进而达到保护缺氧/复氧损伤心肌的目的。结论:1.结合文献调研与初步药效实验结果,选择荭草苷、槲皮苷、牡荆素进行组合药物设计;2.采用均匀设计为试验设计方法,以H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤为实验研究模型,逐步回归分析为建模准则,模拟退火算法为计算理论,计算出最佳配比组合OQV-e,即荭草苷12.55 μM、槲皮苷39.99μM、牡荆素19.223.3.OQV-e抗MIRI的良好药效可能是通过抑制JNK信号通路,抑制过度自噬,进而达到保护缺氧/复氧损伤心肌的目的。
【学位单位】：中央民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R284;R285
【部分图文】：

心肌缺血再灌注过程所涉及的机制通常认为有：活性氧自由基（ｒｅａｃｔｉｖｅ??ｏｘｙｇｅｎ?ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的作用、细胞内妈超载、线粒体膜电位崩解、细胞凋亡与??自噬、炎症反应、内质网应激等［１（）］。如图１－１所示，在心肌再灌注过程中，生理??Ｉｓｃｈｅｍｉｃ?Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ??－３?Ｉｎｊｕｒｙ??Ｏｖｅｒｌｏａｄ?Ｊ?３?Ｉ?Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ?；?．??ＰＴＰ?Ｏｐｅｎｉｎｇ?］??ＴＬＲ４?Ｓ?ＴＬＲ２??图１－１缺血再灌注损伤过程［１４］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｉｓｃｈｅｍｉａ?ｒｅｐｅｒｆｌｉｓｉｏｎ?ｉｎｊｕｒｙ??ｐＨ值的快速恢复导致Ｃａ＞超载，并使线粒体通透性转换孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ??ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ?ｐｏｒｅ，ｍＰＴＰ）开放，导致?Ｒ０Ｓ?大量生成。ＲＯＳ?的堆积使炎??症因子如ＴＮＦ－ｏｔ，?ＮＦ－Ｋｂ，ＩＬ－６等进一步增强白细胞浸润、细胞黏附分子表达，??引起嗜中性粒细胞的入侵［１１］。??导致Ｍ１ＲＩ损伤的最重要原因是氧化应激反应。在正常情况下，身体产生的??Ｒ０Ｓ可通过内源性机制清除。但当内源性清除功能障碍、自由基大量过剩时，??则会引起Ｒ０Ｓ在细胞内的蓄积，进而引起组织损伤［１２］。当心肌细胞缺血、缺氧??时，内源性清除系统功能（清除Ｒ０Ｓ功能）降低或丧失，但其生成系统活性增??强；当恢复血液和氧气供应时

＾?ｗｍｔ?丨?４??１?＾??＇?ｍｍ?ｃｌ＾，??Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ??图１－２缺血再灌注过程中分子转录机制［１９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ?ｄｕｒｉｎｇ?ｉｓｃｈｅｍｉａ?ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ??另有研究表明，Ｎ？可以通过抑制ＪＮＫ信号通路来减少自噬。ＪＮＫ信号通??路增强会导致不同类型的细胞凋亡，其主要机制之一是磷酸化Ｂｃｌ－２并将其与??Ｂｅｃｌｉｎ－１分离［２５’２６］。ＪＮＫ是一种蛋白激酶，磷酸化后的ｐ－ＪＮＫ可诱导自噬，是??ＭＡＰＫｓ中重要的通路之一，也有研究表明ＪＮＫ及磷酸化ＪＮＫ是ＮＯ参与抑制??自噬的潜在机制［２７］。如图１－３所示为ＭＡＰＫ－ＪＮＫ信号通路参与自噬调控的重要??机制图。被激活的ＪＮＫ１导致氨基酸残基（Ｔｈｒ６９、Ｓｅｒ７０和Ｓｅｒ８７）上的Ｂｃｌ－２磷酸??化，将Ｂｃｌ－２与Ｂｅｃｌｉｎｌ分离，形成Ｂｅｃｌｉｎｌ相关的ＰＩ３Ｋ?ＩＩＩ复合物，从而调控自??噬。Ｂｅｃｌｉｎｌ相关的ＰＩ３Ｋ?ＩＩＩ复合物蛋白在自噬的不同阶段发挥刺激或抑制作用，??ＪＮＫ被激活后磷酸化，从而激活ｃ－Ｊｕｎ／ｃ－Ｆｏｓ，增强其对Ｂｅｄｉｎｌ的转录活性。激??活ＪＮＫ还可以诱导ＦｏｘＯｓ核定位

赶草苷（Ｏｒｉｅｎｔｉｎ）、槲皮苷（Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ?）、牡荆素（Ｖｉｔｅｘｉｎ?）、槲皮素（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ?）、??木犀草素（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、异赶草素（Ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）均为黄酮类单体化合物，其结构??如图２－１。??荭草苷是苗药都木油的主要化学成分。苗医常采用都木油单方或复方治疗胸??口闷胀痛等“毒”性病症［８４］，苗药都木油因其解毒、利湿、止血等功效，有“万能??解毒药”之称［８５］。现代药理研究表明，荭草苷具有保护心血管、抗衰老、抗肿瘤、??抗炎、镇痛、抗病毒、抗菌、保护神经等多种药理作用［５９］。槲皮苷具有抗氧化、??抗肿瘤、降血糖、降血脂、扩张冠脉、抗心律失常、等多种药理作用［８２］；牡荆??素生物活性广泛，具有脑保护、心肌保护、骨保护、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗??菌、降压、解痉以及治疗糖尿病、甲状腺疾病等多种药理作用［８＜）］：木犀草素具??有心脏保护、抗肿瘤、抑菌、抗病毒、降血脂血糖、抗纤维化、抗炎镇痛、免疫??调节等药理作用［７９］；异荭草苷具有抗氧化、抗炎、改善胰岛素抵抗、弱化肝纤??维化发展以及诱导肝癌细胞凋亡等药理作用［８３］；槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、??抗感染、免疫抑制、心血管保护、血糖调节等多种药理作用［８１］。??这六种黄酮类单体的药理作用有同有异，药理作用机制互有交叠。本章以荭??草苷、异荭草苷、牡荆素、槲皮素、槲皮苷、木犀草素六种成分为研究对象，通??过Ｈ９ｃ２细胞毒性实验、缺氧／复氧损伤的药效学评价实验，为后续组分配比优化??试验设计奠定基础。??１５??
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本文编号：2856256