莲心碱抗炎抗氧化作用及机制研究

发布时间：2020-10-26 09:13

　　 目的:本研究通过建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对RAW264.7巨噬细胞的炎症模型,探讨莲心碱的抗炎抗氧化活性及分子机制,在此基础上,通过建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤和佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)诱导的小鼠耳肿胀的动物模型,确证莲心碱的抗炎抗氧化活性。方法:细胞实验,我们采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型。首先使用CCK8法筛选莲心碱的无细胞毒性浓度,流式细胞术(Flow Cytometry)检测细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量,分光光度法检测细胞中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量,免疫印迹法(Western blot)法检测抗氧化应激通路Nrf2/HO-1的蛋白水平;Griess法检测一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的浓度,并利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测前列腺素2(ProstaglandinE2,PGE2)的浓度和促炎性细胞因子的水平、免疫印迹法检测NF-κB and MAPKs炎性信号通路、荧光定量PCR检测炎性基因环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和诱导性一氧化氮和酶(Inducible no synthase,iNOS)mRNA的表达;动物实验,分别进行急性肺损伤和耳肿胀的动物模型,进一步确证莲心碱的抗炎抗氧化活性。BALB/c小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+莲心碱(2 mg/kg、4mg/kg、8 mg/kg)组、地塞米松(5 mg/kg)组,鼻腔滴入法建立LPS诱导的急性肺损伤模型。12 h后,组织学观察肺组织的病理学变化;ELISA检测肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量;Wright-Giemsa检测BALF中中性粒细胞数;BCA法检测总蛋白含量;Evans Blue检测肺毛细血管通透性;分光光度法检测肺匀浆上清中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的活性、MDA的含量、SOD的活性、GSH的含量;流式细胞术检测肺组织中ROS的含量。将40只ICR小鼠随机分为空白组、模型组、莲心碱(100μg/耳、300μg/耳、600μg/耳)组、地塞米松组,除空白组,其它各组涂抹TPA于小鼠右耳内外侧,同时立即涂抹莲心碱和地塞米松。6小时后,HE染色法观察病理学改变,用数字测厚仪测量耳厚度,用打孔器(d=6mm)打孔取双耳相同部位组织,以右耳重量/左耳重量计算肿胀指数。结果:细胞实验结果显示,莲心碱在浓度为8和16μM时可体现出毒性,在0-4μM莲心碱处理对细胞活力没有任何影响,因此,本研究使用无毒浓度(0.5、1、2μM)的莲心碱进行实验。莲心碱能够明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中ROS的产生,降低MDA的含量,提高SOD的活性和GSH的含量,降低炎性介质NO和PGE2的含量,降低促炎细胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β的含量;进一步蛋白检测结果显示,莲心碱处理RAW264.7巨噬细胞后可使Keap1蛋白降解,释放Nrf2,进入细胞核,促进HO-1蛋白表达,也可抑制IκBα的磷酸化和降解以及NF-κB p65的磷酸化,抑制p38、ERK1/2、JNK1/2的磷酸化,从而下调炎性基因i NOS和COX-2的mRNA表达。由此从分子机制说明莲心碱的抗炎抗氧化活性。动物实验结果显示,莲心碱能够改善LPS诱导的小鼠ALI的炎性细胞浸润,支气管肺泡壁增厚和肺充血现象,降低BALF中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量、减少中性粒细胞数、肺匀浆中MPO的活性、BALF中蛋白的含量,降低肺微血管通透性,降低肺匀浆中MDA的含量、肺组织中ROS的含量,增加肺匀浆中SOD的活性和GSH的含量;莲心碱能够减轻TPA诱导的小鼠耳组织炎性细胞浸润和耳肿胀现象,且降低TPA诱导的小鼠耳组织增厚和右耳重量/左耳重量比值。由此从动物水平证明莲心碱的抗炎抗氧化活性。结论:本研究从分子机制上证实了莲心碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的抗氧化作用,进一步从细胞、分子机制上证实了莲心碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用,且从动物水平确证了莲心碱对LPS诱导的小鼠急性肺损伤和TPA诱导的小鼠耳肿胀炎症动物模型起到保护作用,为莲心碱对炎性疾病的治疗及研究提供了理论依据。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
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常用缩写词中英文对照表
前言
第一部分 莲心碱抗氧化作用及机制研究
    1 材料与方法
        1.1 实验细胞
        1.2 药品与试剂
        1.3 仪器
        1.4 实验试剂的配制
        1.5 方法
        1.6 统计分析
    2 结果
        2.1 莲心碱对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用
        2.2 莲心碱对LPS诱导的细胞中ROS含量的影响
        2.3 莲心碱对LPS诱导的氧化指标的影响
        2.4 莲心碱对LPS诱导的Nrf2/HO-1的蛋白表达水平的影响
    3 讨论
    4 结论
第二部分 莲心碱抗炎作用及机制研究
    1 材料与方法
        1.1 实验细胞
        1.2 药品与试剂
        1.3 仪器
        1.4 方法
        1.5 统计分析
    2 结果
        2.1 莲心碱对LPS诱导的炎性介质NO,PGE2含量的影响
        2.2 莲心碱对LPS诱导的TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响
        2.3 莲心碱对LPS诱导的COX-2和iNOSmRNA表达水平的影响
        2.4 莲心碱对LPS诱导的NF-κB和MAPKs蛋白表达水平的影响
    3 讨论
    4 结论
第三部分 莲心碱对LPS诱导的急性肺损伤保护作用及机制研究
    1 材料与方法
        1.1 实验动物
        1.2 药品与试剂
        1.3 仪器
        1.4 方法
        1.5 统计分析
    2 结果
        2.1 莲心碱对小鼠急性肺损伤的病理学的影响
        2.2 莲心碱对BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响
        2.3 莲心碱对细胞计数和MPO活性的影响
        2.4 莲心碱对BALF中的蛋白浓度和肺毛细血管通透性的影响
        2.5 莲心碱对MDA含量、SOD活性、GSH含量和ROS水平的影响
    3 讨论
    4 结论
第四部分 莲心碱对TPA诱导小鼠耳肿胀的抗炎作用研究
    1 材料与方法
        1.1 实验动物
        1.2 药品与试剂
        1.3 仪器
        1.4 方法
        1.5 统计分析
    2 结果
        2.1 莲心碱对小鼠耳肿胀的病理学的影响
        2.2 莲心碱对耳厚度和耳肿胀指标的影响
    3 讨论
    4 结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
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本文编号：2856802