[研究背景]炎症是一把双刃剑,适度的炎症反应有利于机体对抗外界病原微生物的感染,而失调的炎症反应又会使这把利剑挥向机体自身,过度放大或持续存在的炎症反应可以导致机体组织损伤和器质性病变。炎性小体是胞浆内多种蛋白质组成的复合体,这种复合体能够剪切活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)进而在天然免疫防御的过程中促进炎性细胞因子前体(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)和pro-IL-18 的切割成熟,并引起 caspase-1 依赖的编程性细胞死亡(pyroptosis),即焦亡。目前已经发现的能在体内组装成有功能的炎症小体主要有核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptor,NLR)家族的 NLRP3(NLR family,pyrin domain containing3)、NLRP1、包含半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶活化和募集结构域蛋白4(NLR family,caspase activation and recruitment domain(CARD)domain containing 4,NLRC4)、AIM2(absent in melanoma 2)等。由于可以被不同类型的激活剂活化,包括病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns.PAMP)或损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),如代谢产物,如高血糖、饱和脂肪酸、胆固醇结晶、尿酸结晶等,因此NLRP3炎症小体是目前研究最为深入和广泛的一类炎症小体。NLRP3 炎症小体是由细胞内受体NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)以及 caspase-1 共同组成的高分子量蛋白复合物,具有病原体识别功能,既能感应体内稳态的改变,也能被多种组织损伤信号激活。NLRP3炎症小体持续活化会使促炎因子过度表达,导致慢性炎症的发生,如2型糖尿病、神经退行性疾病、动脉粥样硬化、痛风及肿瘤等。因此,寻找和发现NLRP3炎症小体抑制剂,是防治相关疾病的一条重要途径。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚结构的次生代谢物,至今已有超过8000名成员被确认,如来自姜黄的姜黄素(Curcumin,CUR),或绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)等。流行病学研究、体内和体外研究、以及临床试验结果均建议合理增加多酚摄入,可以降低罹患慢性病的风险,改善人类健康,归因于其抗氧化,抗炎,抗肿瘤等生物学和药理学作用。姜黄作为一种常见的东方香料,在亚洲烹饪中经常被使用,尤其是印度、巴基斯坦和泰国。姜黄素是姜黄根状茎的主要成分,是一种多酚类化合物。姜黄素作为抗炎药物已有很长的使用历史,体外和体内研究均表明,姜黄素能抑制炎症,并且无明显毒副作用,被应用于多种炎症性疾病,包括肥胖、糖尿病、心血管疾病、支气管哮喘和风湿性关节炎等。EGCG是绿茶茶多酚的主要成分,是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体,也是研究非常广泛的多酚类化合物,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎以及抗肿瘤等作用。尽管如此,对于上述多酚类化合物的生物学作用机制研究并不深入。那么,植物多酚抗炎功能如此广泛,是否与具有广泛激活剂的NLRP3炎症小体有关联?我们结果显示,姜黄素和EGCG均可抑制NLRP3炎症小体的活化,是发挥抗炎作用的重要机制。通过细胞实验及小鼠体内实验,对于姜黄素和EGCG抑制NLRP3炎症小体活化的信号通路,包括钾离子外流、活性氧、受损线粒体在细胞内的定位、焦亡等机制进行了深入研究。姜黄素和EGCG生物学作用广泛,为炎症小体活化的机制研究提供了新的候选分子,并且本研究揭示了姜黄素及EGCG新的抗炎机制,为其在NLRP3炎症小体参与的疾病中的临床应用提供了理论基础。第一部分:姜黄素通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用的研究研究目的:通过小鼠骨髓来源的巨噬细胞等细胞实验,及野生型或Nlrp3-/-小鼠实验,1.明确姜黄素对NLRP3炎症小体的抑制作用;2.研究姜黄素抑制NLRP3炎症小体活化的机制。研究方法:1.炎症小体的活化小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)或人单核细胞系THP-1常规培养,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及刺激剂,如单钠尿酸盐结晶(monosodium urate crystal,MSU),铝佐剂(Alum),咪喹莫特(Imiquimod,R837)及尼日利亚菌素(Nigericin),诱导NLRP3炎性小体的活化;poly(dA:dT)刺激AIM2炎性小体的活化;鼠伤寒沙门氏菌感染细胞活化NLRC4炎症小体。2.酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA)测定巨噬细胞培养上清或血清中 IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF--α)等的含量。3.蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)分析巨噬细胞裂解物中pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC多聚体、NLRP3、actin等蛋白表达;以及培养上清液中pro-caspasel具有活性的片段p20及pro-IL-1β的活化形式IL-1β的分泌。4.乳酸脱氢酶释放法(lactate dehydrogenase,LDH release assay)测定细胞培养上清中LDH的活性,从而分析姜黄素的细胞毒性及姜黄素对NLRP3-caspase-1通路活化引发的细胞焦亡影响。5.激光共聚焦扫描显微镜(confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)分析细胞荧光蛋白表达等:5.1 MitoSOX标记线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS),共聚焦显微镜观察并获取图像,运用图像处理软件Image J分析荧光强度,以反映细胞内线粒体活性氧的水平;5.2Mitotracker标记线粒体,共聚焦显微镜观察并获取图像,Image J分析荧光强度,以反映细胞内线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)变化;5.3钾离子荧光探针Asante Potassium Green 2(APG-2)标记钾离子,共聚焦显微镜观察并获取图像,Image J分析荧光强度,分析细胞内钾离子浓度变化;5.4以TOM20标记线粒体,tubulin标记细胞微管,Alexa Fluor二抗孵育,共聚焦显微镜观察并获取图像,测定线粒体在细胞内的定位和形态;5.5免疫荧光抗体标记ASC,共聚焦显微镜观察并获取图像,计数ASC斑点形成的个数。6.NAD/NADH定量试剂盒测定细胞内NAD+水平,分析实验不同组细胞NAD+水平的相对浓度。7.电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma optical emission spectrometry,ICP-OES)测定细胞内钾离子的浓度水平。8.腹腔注射MSU诱导小鼠急性腹膜炎模型,流式细胞术计数炎性细胞等,明确姜黄素在体内对NLRP3通路的抑制作用。9.高脂饮食诱导野生型(widetype,WT)C57BL/6小鼠和N]rp3-/-小鼠的2型糖尿病模型,分析姜黄素对NLRP3通路的抑制作用与其疗效的相关性。结果:1.小鼠BMDMs实验,在LPS启动NLRP3炎症小体活化之前,给与姜黄素,WB结果显示,姜黄素在30-50μM,剂量依赖的抑制pro-IL-1β的表达、caspase-1 的活化和 IL-1β 的分泌;ELISA 结果显示,IL-1β、IL-18、TNF-α 的分泌(P0.01)。2.在LPS启动NLRP3炎症小体第一信号之后,给与姜黄素处理,然后用尼日利亚菌素活化炎症小体,WB结果显示,姜黄素在30-50 μM,剂量依赖的抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌,ELISA实验进一步验证了上述结果(P0.001),而TNF-α的分泌无影响(p0.05)。3.运用不同类型的刺激剂活化炎症小体,WB和ELISA发现,姜黄素均下调了caspase-1的活化和IL-1β的分泌,而姜黄素对于NLRC4、AIM2炎症小体活化无抑制作用。4.运用THP1细胞的NLRP3炎症小体活化实验模型,WB结果显示,与小鼠骨髓巨噬细胞的实验结果一致,姜黄素同样可以抑制人来源的巨噬细胞caspase-1的活化和IL-1β的分泌。5.WB和ELISA结果表明,与姜黄素类似的化合物去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin,DMC),双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin,BDMC)均可以抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌,而姜黄素体内代谢的氢化衍生物四氢姜黄素(tetrahydrocurcum in,THC)无明显抑制作用。COX-2选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)并不能逆转姜黄素的抑制作用。6.共聚焦显微镜和ICP-OES的结果均显示,姜黄素抑制尼日利亚菌素或尿酸盐晶体诱导的NLRP3炎症小体的活化过程中,细胞内的钾离子外流减少。7.姜黄素在抑制尼日利亚菌素或尿酸盐晶体诱导的NLRP3炎症小体活化过程中,检测ROS、ΔΨm及NAD+等指标,发现线粒体损伤增加。8.在尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体活化细胞模型中,图像显示姜黄素阻止了尼日利亚菌素诱导的受损线粒体到核周区域的转运,而这种微管驱动的线粒体空间定位的阻滞过程并不依赖微管乙酰化水平。9.WB显示姜黄素减少了 NLRP3炎症小体组装过程中ASC二聚体的形成,成像显示ASC斑点明显减少。10.姜黄素减轻了尿酸盐晶体诱导的小鼠腹膜炎模型的炎症反应,包括血清及腹腔灌洗液中IL-1β的分泌减低,中性粒细胞的数量减少。11.姜黄素缓解WT小鼠高脂饮食诱导的胰岛素抵抗,降低了高脂饮食诱导的炎症因子,包括IL-1β、IL-18在血清或肝脏组织培养上清中的分泌,而Nlrp3-/-小鼠未呈现缓解作用。结论:1.姜黄素特异性地抑制NLRP3炎症小体的启动与组装活化过程;2.姜黄素通过阻止K+外流及下游线粒体的空间定位、ASC二聚体和斑点的形成,从而抑制NLRP3炎症小体活化;3.姜黄素可以通过抑制NLRP3炎症小体活化,缓解尿酸盐晶体诱导的急性腹膜炎症及高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。第二部分:EGCG通过抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用的研究研究目的:通过小鼠骨髓来源的巨噬细胞、人单核细胞的NLRP3炎症小体活化模型,及高脂饮食诱导的野生型小鼠2型糖尿病模型,1.明确EGCG对NLRP3炎症小体的抑制作用;2.研究EGCG抑制NLRP3炎症小体活化的机制。研究方法:1.炎症小体的活化小鼠BMDMs或THP-1细胞常规培养,LPS及刺激剂,如MSU、Alum、R837及Nigericin,诱导NLRP3炎性小体活化。2.ELISA测定巨噬细胞培养上清或血清中IL-1β、IL-18、TNF-α等的含量。3.WB分析巨噬细胞裂解物中pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC多聚体、NLRP3、actin等蛋白水平表达；以及培养上清液中pro-caspase1具有活性的片段p20及pro-IL-1β的活化形式IL-1β分泌。4..LDH释放法测定细胞培养上清中LDH的活性,从而分析EGCG的细胞毒性及EGCG对NLRP3-caspase-1通路活化引发的细胞焦亡的影响。5.激光共聚焦扫描显微镜分析细胞荧光蛋白表达等:5.1 MitoSOX标记线粒体ROS,共聚焦显微镜观察并获取图像,运用图像处理软件Image J分析荧光强度,以反映细胞内线粒体活性氧的水平;5.2 Mitotracker标记线粒体,共聚焦显微镜观察并获取图像,ImageJ分析荧光强度,以反映细胞ΔΨm变化；5.3钾离子荧光探针APG-2标记钾离子,共聚焦显微镜观察并获取图像,ImageJ分析荧光强度,分析细胞内钾离子浓度变化;5.4 以TOM20标记线粒体,tubulin标记细胞微管,Alexa Fluor二抗孵育,共聚焦显微镜观察并获取图像,测定线粒体在细胞内的定位;5.5免疫荧光抗体标记ASC蛋白,共聚焦显微镜观察并获取图像,计数ASC斑点形成的个数;6.NAD/NADH定量试剂盒测定细胞内NAD+水平,分析实验不同组细胞NAD+的相对浓度。7.建立高脂饮食诱导C57BL/6肥胖小鼠模型,分析EGCG对NLRP3通路在体内的抑制作用。结果:1.小鼠BMDMs实验,在LPS启动NLRP3炎症小体活化之前,ELISA结果显示,EGCG 下调 IL-1β、IL-18、TNF-α 的分泌(P0.01)。2.在LPS启动NLRP3炎症小体第一信号之后,给与EGCG处理,然后用尼日利亚菌素活化炎症小体,WB结果显示,姜黄素在20-40μM,剂量依赖的抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌,ELISA实验进一步验证了上述结果(P0.001),而TNF-α的分泌无影响(p0.05)。3.运用不同类型的刺激剂活化炎症小体,ELISA发现,EGCG均下调了IL-1β、IL-18的分泌。4.运用人THP1细胞NLRP3炎症小体活化实验模型,ELISA结果显示,与小鼠BMDMs结果一致,EGCG同样可以抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌。5.共聚焦显微镜和ICP-OES的结果均显示,EGCG抑制尼日利亚菌素或尿酸盐晶体诱导的NLRP3炎症小体的活化过程中,细胞内的钾离子外流无明显改变。6.EGCG在抑制尼日利亚菌素或尿酸盐晶体诱导的NLRP3炎症小体活化过程中,线粒体ROS下调,然而鱼藤酮不能逆转EGCG对NLRP3的抑制作用。并且EGCG进一步降低了线粒体的AΨm及NAD+等,显示EGCG使线粒体的损伤增加。7.在抑制尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体活化过程中,成像显示EGCG阻止了尼日利亚菌素诱导的受损线粒体到核周区域的转运,而这种微管驱动的线粒体空间定位阻滞过程不依赖微管乙酰化水平。8.WB显示EGCG减少了 NLRP3炎症小体组装过程中ASC二聚体的形成,成像显示ASC斑点明显减少。9.高脂饮食诱导C57BL/6肥胖小鼠中,在同样条件的刺激剂诱导下吗,与仅高脂饮食喂养的肥胖小鼠来源的BMDMs细胞比较,给予EGCG及高脂饮食的肥胖小鼠来源的细胞显示caspase-1活化水平明显减低,炎性因子IL-1β分泌明显减少。结论:1.EGCG可抑制NLRP3炎症小体的启动与组装活化过程;2.EGCG通过阻滞受损线粒体的空间定位、减少ASC斑点的形成等机制,抑制NLRP3炎症小体活化;3.EGCG可降低肥胖小鼠NLRP3炎症小体活化水平。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285
【部分图文】：
图２．姜黄素抑制炎症小体活化的第二信号。??姜黄素处理ＬＰＳ诱导的ＢＭＤＭ细胞１小时，然后用ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ刺激活化ＮＬＲＰ３??炎症小体。（Ａ）免疫印迹分析培养基上清液和细胞提取物的ｃａｓｐａｓｅ－１活化和ＩＬ－１Ｐ??分泌；（Ｂ）免疫印迹分析培养基细胞提取蛋白中，ＮＬＲＰ３组装原件ＡＳＣ、ＮＬＲＰ３??
图３．姜黄素抑制不同刺激剂诱导的小鼠ＮＬＲＰ３炎性小体活化。??姜黄素（４〇ｎＭ）处理ＬＰＳ诱导的ＢＭＤＭｓ?１小时，然后用Ｒ８３７、ＭＳＵ、Ａｌｕｍ??和ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ进行刺激活化ＮＬＲＰ３炎症小体。（Ａ）运用免疫印迹法分析培养基上清??液和细胞提取物中的ｃａｓａｓｅ－１；－ａｃｔｉｎ。Ｐ－－
图４．姜黄素抑制人单核细胞中的ＮＬＲＰ３炎性体活化。??姜黄素处理后用ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ刺激ＰＭＡ分化的ＴＨＰ－１细胞，免疫印迹分析ＩＬ－］?ｐ??和ｃａｓｐａｓｅ－１活化。［３－ａｃｔｉｎ作为上样对照。Ｐｒｏ－ｃａｓｐｌ?（ｃａｓｐａｓｅ－１前体），无生物活
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