“桔梗—甘草”联合羟基喜树碱的药动学及抗肺癌作用研究

发布时间：2020-10-29 23:19

　　 目的:运用LC-MS/MS分析技术,探究“桔梗-甘草”与羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin,HCPT)联合用药前后大鼠血浆药代动力学和小鼠组织分布的差异性,并结合“桔梗-甘草”与羟基喜树碱联合应用对lewis肺癌荷瘤小鼠的药效作用,以此阐明“桔梗-甘草”增强羟基喜树碱肺部输送作用及抗肿瘤作用,以期为肺癌临床治疗方案提供一种新的策略。方法:(1)以SD大鼠为研究对象,随机分2组,分别为HCPT组和“桔梗-甘草”联合HCPT组,给药后,于不同时间点采集其血浆,进行样品处理,运用LC-MS/MS技术测定羟基喜树碱在血浆中的含量,分析“桔梗-甘草”与羟基喜树碱联合用药前后在大鼠体内的药代动力学差异。(2)以C57BL/6小鼠为研究对象,随机分为2组,分别为羟基喜树碱组和“桔梗-甘草”联合羟基喜树碱组,给药后,于不同时间点采小鼠组织(心、肝、脾、肺、肾)。样品处理后,运用LC-MS/MS技术测定羟基喜树碱在不同组织中的含量。(3)以C57BL/6小鼠为研究对象,建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,选取造模成功的小鼠随机分为5组,给药期间,每日给小鼠称重,于给药后第1、4、7、11、13、15天用游标卡尺测量小鼠瘤径,用于计算瘤体积;给药后第16天,先取小鼠眼眶血用于血常规的测定,以及使用ELISA试剂盒测定小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-10的含量;剥取瘤组织,称重,计算抑瘤率;取小鼠心、肝、脾、肺、肾组织用于计算小鼠脏器指数。结果:(1)本实验建立的测定大鼠血浆中羟基喜树碱的LC-MS/MS定量分析方法结果显示,大鼠空白血浆不加羟基喜树碱标准溶液及内标溶液中未检测到羟基喜树碱及内标物,各成分分离良好;羟基喜树碱在1.36~2728ng/ml范围内线性良好;回收率和基质效应均在80%以上;日内、日间精密度(RSD)范围为0.72~3.77%,准确度(RE)范围为6.83~10.29%;稳定性(RSD)范围为2.25~7.60%。药动学实验显示,“桔梗-甘草”联合羟基喜树碱后的药动学参数AUC_((0-t))(1176.268±343.014)ug/L*h和C_(max)(2604.4±865.009)ug/L较羟基喜树碱单独组的AUC_((0-t))(926.356±231.58)ug/L*h和C_(max)(2139.2±668.692)ug/L都增大了,但均无统计学差异(P0.05)。(2)建立了测定C57BL/6小鼠组织中羟基喜树碱的含量的LC-MS/MS方法,专属性较好,其它成分对羟基喜树碱及内标喜树碱均没有干扰。各个组织标准曲线在一定线性范围为线性良好,回收率和基质效应均大于75%,日内、日间精密度(RSD)范围为1.2~9.58%,准确度(RE)范围为-13.4~11.45%,稳定性(RSD)范围为0.47~12.56%。“桔梗-甘草”和羟基喜树碱联合运用后,药动学参数显示,与羟基喜树碱单独给药比较,在肺组织中AUC_((0-t))增大约2.41倍,且肺组织中的药物峰浓度增大了约1.41倍;在心组织中AUC_((0-t))增大了1.76倍;在肝组织中,AUC_((0-t))增大了1.42倍;在脾组织中AUC_((0-t))增大了约1.99倍;;并且联合给药组中心、肝、脾、肺组织的CLz较羟基喜树碱单独给药组显著减小(P0.01)。(3)“桔梗-甘草”联合羟基喜树碱的抗肺癌作用结果显示,在抑瘤率方面,给药第16天,羟基喜树碱单独给药组的抑瘤率为32.93%,而“桔梗-甘草”低、中、高剂量分别联合羟基喜树碱给药组的抑瘤率为33.79%、47.14%和50.36%;小鼠外周血常规结果显示,与羟基喜树碱单独给药组相比,“桔梗-甘草”高剂量与羟基喜树碱联合应用可显著增加红细胞、血红蛋白和血小板水平(P0.05)。ELISA试剂盒检测结果显示,与羟基喜树碱单独给药组比较,“桔梗-甘草”中、高剂量联合羟基喜树碱给药组小鼠血清中IL-2的含量具有显著性提升(P0.01),而IL-10的含量显著性降低(P0.01);“桔梗-甘草”高剂量联合羟基喜树碱给药组小鼠血清中IFN-γ的含量具有显著性提升(P0.01)。结论:(1)建立的测定大鼠血浆中羟基喜树碱的LC-MS/MS定量分析方法可靠、灵敏度好、快速准确,可适用于大鼠血浆中羟基喜树碱的药动学研究和浓度测定。药动学实验结果显示,“桔梗-甘草”有一定的提高羟基喜树碱在大鼠血浆药物浓度的作用,“桔梗-甘草”对羟基喜树碱在大鼠血浆中的药代动力学行为有一定的影响。(2)建立的测定小鼠组织中羟基喜树碱的LC-MS/MS定量分析方法符合生物样品检测要求,可用于检测小鼠组织中羟基喜树碱的含量。组织分布实验结果显示,“桔梗-甘草”显著地提高了羟基喜树碱在心、肺、肝、脾组织中的分布浓度,延长了羟基喜树碱在心、肺、肝、脾组织中的消除过程,表明“桔梗-甘草”可能不仅可以增强羟基喜树碱在肺的分布,同时还增强了羟基喜树碱在心、肝和脾的分布。(3)Lewis肺癌荷瘤小鼠模型的药效研究结果表明,“桔梗-甘草”可以提高羟基喜树碱的抑瘤率,其作用可能与联合给药后IL-10表达下降,IL-2、IFN-γ表达提高,红细胞、血红蛋白和血小板水平显著增加,机体免疫增强,药物毒副作用降低有关。综上所述,“桔梗-甘草”与羟基喜树碱合用后,可以促进羟基喜树碱在心、肝、肺、脾组织的分布,提高羟基喜树碱对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤率,增强Lewis肺癌荷瘤模型小鼠的免疫力。这些研究结果在一定程度上证实了“桔梗-甘草”药对在中医理论上的引经作用,同时,可为“桔梗-甘草”与抗癌药物临床方案的制定提供新的策略。
【学位单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

图 1.1 羟基喜树碱（A）和喜树碱（B）的结构式Fig.1.1 Structure of Hydroxycamptothecin(A) and Camptothecin(B)图 1.2 羟基喜树碱(A)和喜树碱(B)的质谱图ig.1.2 Mass spectrogram of Hydroxycamptothecin(A)and Camptothecin(B)方法学考察1 方法专属性密吸取大鼠空白血浆 50μL 于 1.5ml 管中，除了不加内标外，其余按“2品处理”项下操作，进样分析可以得空白血浆样品色谱图；然后在 5020 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360m/z, Da365.1321.0203.0185.0258.7 302.9218.9293.1100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z Da0.02.0e64.0e66.0e68.0e61.0e71.2e71.4e71.6e71.8e72.0e72.2e7Intnestiy,cps349.1114.0314.1109.1123.0209.0 305.0240.1258.1228.0322.1137.8115.0 257.2112.2152.0 166.1 209.8 340.3AB

大鼠单次尾静脉注射羟基喜树碱注射液和“桔梗-甘草”联合羟注射液的平均血药浓度-时间曲线（Mean±SD，n=6）.4 Mean plasma concentration-time curve in rats following single taadministration of HCPT or JGGC-HCPT (Mean±SD，n=6)谱条件的建立及优化验建立及优化了羟基喜树碱的质谱条件，实验中考察了正离子扫离子峰度，确定一级检测离子。然后对所监测离子进行选择离源的最优条件，同时通过产物离子扫描，分析裂解规律，确定最优去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）等质谱参数。谱条件的确定

AUC(0-t)ug/L*h 398.35±79.36 497.01±54.23AUC(0-∞)ug/L*h 417.49±73.61 536.83±82.26MRT(0-t)h 1.70±0.03 1.92±0.162MRT(0-∞)h 2.18±0.29 2.63±1.03t1/2h 2.08±0.74 2.07±1.07Tmaxh 0.60±0.22 0.45±0.11CLz L/h/kg 9.59±1.79 7.39±1.06Cmaxug/L 280.30±94.07 405.79±133.81注：与羟基喜树碱单独给药组相比，*P<0.05，**P<0.01Compared with the HCPT alone drug group, *P<0.05，**P<0.01
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本文编号：2861613