扶正化瘀方抗肝纤维化的网络多靶标作用机制研究

发布时间：2020-11-01 09:23

　　 肝纤维化是慢性肝损伤所致的病理改变,是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段,可严重影响肝脏功能,产生多种并发症,甚至危及生命。肝纤维化的特征在于细胞外基质蛋白(Extracellular matrix protein,ECM)过度积累,而具有纤维化和增殖性的活化状态的肝星状细胞是ECM的主要来源,因此抑制肝星状细胞活化是治疗肝纤维化的重要策略之一。扶正化瘀方是由上海中医药大学针对肝纤维化血瘀研制,该复方由丹参、桃仁、五味子、冬虫夏草、绞股蓝、松花粉六味药材组成,丹参在方中活血祛瘀作为君药;冬虫夏草补虚损、益精气,桃仁助丹参活血祛瘀,共为臣药;松花粉益气润燥,绞股蓝清热解毒,共为佐药;五味子味酸,为引经使药。诸药合用,活血化瘀,益精养肝,从而达到抗肝纤维化的效果。目前对于扶正化瘀方化学物质基础和抗肝纤维化的作用机制研究尚不全面。而以整体性、系统性为特点的网络药理学,注重从整体出发探索药物与疾病之间的关系,这与中医药整体观、辨证论治、方剂配伍的原则不谋而合。因此本课题以扶正化瘀方化学物质组研究为基础,运用网络药理学与多种组学结合的方法初步探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。本文研究内容主要分为以下三个部分:1、扶正化瘀方体内外化学成分的快速鉴别采用UHPLC-Q-TOF/MS方法快速鉴别扶正化瘀方的体内外化学成分。正、负离子模式下采集的质谱信息,并建立扶正化瘀方化学成分库进行数据分析,在扶正化瘀方中共鉴别到153种体外化学成分和49种体内化学成分,为下一步运用网络药理学方法探讨扶正化瘀方中抗肝纤维化的有效成分及作用机制奠定基础。2、联合网络药理学和转录组学方法探讨扶正化瘀方抑制肝星状细胞活化的活性成分及作用机制基于扶正化瘀方的体内外化学物质组,采用文本挖掘的方法筛选出复方的潜在活性成分。然后,联合相似性匹配和分子对接的方法,从扶正化瘀方中筛选出抗肝纤维化的40个有效成分和79种潜在靶标。为了提高靶标鉴别的准确性,我们联合转录组学数据构建了“成分-靶标-差异基因蛋白”网络,将79种潜在靶标减少至31种。对靶蛋白的富集分析结果表明:扶正化瘀方可能主要通过调节HIF-1、PI3KAkt、FoxO和趋化因子等信号通路抑制肝星状细胞活性,从而具有治疗肝纤维化的作用。最后,我们采用CCK8法对扶正化瘀方中的15个潜在活性成分抑制肝星状细胞活化的活力进行了检测,实验结果表明二氢丹参酮Ⅰ、五味子酯甲、五味子乙素、丹酚酸A、丹酚酸B、丹参酮II-A、虫草素和山奈酚可以显著地降低肝星状细胞(大鼠肝星状细胞系-T6细胞和人肝星状细胞系-LX-2细胞)的活性,进而发挥抗纤维化作用,其中二氢丹参酮Ⅰ的抑制活力最强(T6细胞IC50=5.6μM;LX-2细胞IC50=14.4μM)。在筛选得到的31个潜在靶蛋白中,我们选择过氧化物酶体增殖物激活剂受体γ(Peroxisome proliferative activated receptorγ,PPARG)进行了细胞水平和分子水平的实验验证。结果表明,五味子乙素、丹酚酸A和山奈酚可直接与PPARG结合,降低肝星状细胞(T6细胞和LX-2细胞)的活力,发挥抗纤维化作用。3、基于“蛋白-代谢物相互作用”策略研究二氢丹参酮Ⅰ抑制肝星状细胞活化的网络多靶标作用机制基于上述研究,我们采用文本挖掘、相似性匹配和分子对接等网络药理学方法识别了182个二氢丹参酮Ⅰ抗肝纤维化的潜在靶标,为了更准确的定位其靶蛋白,我们进一步结合代谢组学数据,构建了“二氢丹参酮Ⅰ-肝纤维化相关蛋白-代谢物相关蛋白-代谢物”网络,经网络分析后筛选出二氢丹参酮Ⅰ最相关的靶标STAT3和P53。最后,通过体内外实验,具体为流式细胞仪、表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)分析、免疫印迹实验(Western blotting)、代谢组学实验以及硫代乙酰胺诱导的肝纤维化大鼠实验对二氢丹参酮Ⅰ与STAT3和P53之间的相互作用和效应进行了验证,实验结果表明二氢丹参酮Ⅰ通过靶向STAT3和P53抑制肝星状细胞活化,进而缓解肝纤维化的发生发展。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

海军军医大学硕士学位论文（二）UHPLC-Q-TOF/MS 对扶正化瘀胶囊体外化学成分的鉴别精密吸取扶正化瘀胶囊供试品溶液和对照品混合溶液 200 μL于进样小瓶，按照上述色谱和质谱的测试条件进行样品分析，得到扶正化瘀方样品溶液正、负离子模式下的总离子流图，如图 2-1所示。

丹参酮ⅡA、二氢丹参酮 I在扶正化瘀胶囊供试品和对照品混合溶液正离子模式下提取离子流图如图 2-2B、图2-2D 和图 2-2C、图 2-2E。2、化合物鉴别以正离子模式下 4号峰丹参酮ⅡA为例介绍扶正化瘀胶囊中色谱峰的鉴别过程。TIC 图中的保留时间为 8.751 min（图 2-2B）的色谱峰显示的准分子离子为295.1362，利用 Qualiative Analysis 软件分析工具计算精确质量数的可能的元素组成(<5 ppm)，结合数据库中已知化合物的质荷比，初步确定分子式为 C19H18O3。通过计算该准分子离子的核素分布情况，从图 2-3A可以看出同位素分布的理论值与实际值恰好吻合，确定此峰为丹参酮ⅡA。同理可得该模式下 2号峰二氢丹参酮 I的解析过程，如图 2-3B。

1. 丹酚酸 B；2. 二氢丹参酮 I；3. 丹酚酸 A；4. 丹参酮ⅡA；5. 苦杏仁苷；6. 虫草素；7. 五味子醇甲；8.五味子乙素；9. 五味子酯甲；10. 山柰酚Figure 2-2 Total ion current map and extracted ion flow diagram of the solution ofFuzheng Huayu Capsule and control sampleA. Total ion chromatogram in positive ion mode of mixed solution of reference substanceB. Ion flow diagram of tanshinone IIA extracted from test solution of Fuzheng HuayuCapsule; C. Ion flow diagram of tanshinone IIA extracted from mixed solution of referencsubstance; D. Ion flow diagram of dihydrotanshinone I extracted from the solution ofHuayu Capsule; E. Ion flow diagram of dihydrotanshinone I extracted from the mixedsolution of reference substance1. salvianolic acid B; 2. dihydrotanshinone I; 3. salvianolic acid A; 4. tanshinone IIA; 5.amygdalin; 6. cordycepin; 7. schisandrin; 8. Schisandrin B;9. schisantherinA;10.kaempferol
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本文编号：2865335