基于网络药理学的白花蛇舌草治疗胃肠道癌作用机制研究

发布时间：2020-11-01 09:46

　　 在全球范围内,胃癌发病率居恶性肿瘤第5位,死亡率居第3位;结直肠癌发病率居恶性肿瘤第3位,死亡率居第2位。中医药在肿瘤的治疗中应用广泛,具有独特的优势和巨大的潜力。同时,由于中药多成分、多靶点和多途径协同作用的复杂性及传统实验方法的局限性,大多数中药的药效物质基础、分子靶标及作用机制仍然不明确,这成为中药应用和中药新药研发的主要障碍之一。白花蛇舌草是中医常用的清热类药,具有清热解毒、消痈散结、利尿除湿等功效,临床上广泛应用于胃肠道癌的治疗,然而其作用机制尚未充分阐明。网络药理学以“疾病-基因-靶点-药物”多层次、多角度的相互作用网络为理念,系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响,已广泛应用于中药作用机制的研究。基于此,本研究通过网络药理学方法探索白花蛇舌草抗胃肠道癌的作用机制。研究目的通过整合基因表达谱分析确认胃肠道癌潜在预后标志物。通过网络药理学方法预测、辨识白花蛇舌草治疗胃肠道癌的活性成分、作用靶点和信号通路,构建生物分子网络,力求从系统层面揭示白花蛇舌草抗胃肠道癌的多成分、多靶点、多通路复杂机制。研究方法1.整合基因表达谱分析在基于整合基因表达谱的胃癌潜在预后标志物研究中,从GEO数据库下载9个胃癌基因表达谱芯片数据集,利用R语言中的limma包对每个数据集分别进行差异表达分析,进一步通过RobustRankAggreg包进行整合分析,筛选出在9个数据集中共同被确认为差异表达的基因。从TCGA数据库下载胃腺癌mRNA测序数据和病人的临床信息,利用edgeR包确认差异表达基因,并将这些基因与胃癌芯片数据集整合分析得到的差异基因取交集,筛选共同的差异基因。使用STRING获取差异基因的蛋白相互作用信息,导入Cytoscape构建蛋白互作网络,并利用MCODE进行模块分析,获得网络的核心基因。通过DAVID对核心模块中的基因进行GO富集分析,通过clusterProfiler包对核心模块中的基因进行KEGG通路富集分析。合并TCGA中胃癌患者的生存数据和基因表达数据,采用survival包进行单因素Cox回归分析,选取P0.05的基因进行多因素Cox回归分析。基于所选基因表达谱和回归系数构建生存相关的线性风险评估模型,计算每个样本的风险值,通过Kaplan-Meier和Log-rank检验的方法评估高、低风险组样本总体生存率的差异,采用时间依赖性ROC曲线评价该预后模型对时间依赖性癌症死亡的预测准确性。在基于整合基因表达谱的结直肠癌潜在预后标志物研究中,从GEO数据库下载6个结直肠癌基因表达谱芯片数据集,利用limma包对每个数据集分别进行差异表达分析,进一步通过RobustRankAggreg包进行整合分析,筛选出在6个数据集中共同被确认为差异表达的基因。从TCGA数据库下载结肠腺癌mRNA测序数据和病人的临床信息,利用edgeR包确认差异表达基因,并将这些基因与结直肠癌芯片数据集整合分析得到的差异基因取交集,筛选共同的差异基因。采用KEGG的功能注释信息,通过clusterProfiler包分别对7个数据集中的全部基因进行GSEA富集分析。合并TCGA中结肠癌患者的生存数据和基因表达数据,采用survival包进行单因素Cox回归分析,通过glmnet包对P0.05的基因进行LASSO Cox回归分析,最后应用survival包对LASSO Cox回归分析确认的生存相关基因进行多因素Cox回归分析。基于所选基因表达谱和回归系数构建生存相关的线性风险评估模型,计算每个样本的风险值,通过Kaplan-Meier和Log-rank检验的方法评估高、低风险组样本总体生存率的差异,采用时间依赖性ROC曲线评价该预后模型对时间依赖性癌症死亡的预测准确性。2.网络药理学分析在白花蛇舌草治疗胃癌作用机制的网络药理学研究中,通过TCMSP、TCMID获得白花蛇舌草的化学成分,通过SuperPred预测化学成分的靶点,通过TTD、OMIM、PharmGKB、DigSee获得胃癌相关基因,通过STRING获得蛋白质相互作用信息。运用Cytoscape软件构建“化合物-化合物靶点网络”、“化合物靶点蛋白互作网络”、“胃癌蛋白互作网络”、“化合物靶点-胃癌靶点蛋白互作网络”,并对网络的关键拓扑参数进行分析。运用MCODE对网络进行模块分析,识别网络中的核心聚类模块。通过DAVID对模块中的基因进行GO富集和KEGG通路富集分析。在白花蛇舌草治疗结直肠癌作用机制的网络药理学研究中,通过TCMSP、TCMID、TCM Database@Taiwan获得白花蛇舌草的化学成分,通过PharmMapper预测化学成分的靶点,通过DisGeNET获得结直肠癌相关基因,通过STRING获得蛋白质相互作用信息。运用Cytoscape软件构建“化合物-化合物靶点网络”、“结直肠癌蛋白互作网络”、“化合物-结直肠癌靶点蛋白互作网络”,对网络的关键拓扑参数进行分析,确认白花蛇舌草治疗结直肠癌的潜在核心靶点,通过DAVID对其进行GO富集和KEGG通路富集分析。研究结果1.胃肠道癌整合基因表达谱分析结果对9个胃癌芯片数据集进行整合分析,得到411个差异基因,对TCGA胃癌测序数据进行分析,得到4623个差异基因,对这些差异基因取交集,最终共得到268个共同差异基因(149个下调基因,119个上调基因)。蛋白互作网络和模块分析得到3个核心聚类模块和9个核心基因(TOP2A、COL1A1、COL1A2、COL3A1、NDC80、CDKN3、CEP55、TPX2、TIMP1)。功能富集分析显示,下调基因主要参与多种代谢过程,包括异生素、辅助因子、维生素、氨基酸、碳水化合物等的代谢,上调基因主要富集在癌症相关通路,如ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路等。生存分析得到9个基因构建预后模型,3个基因(COL8A1、SMPD3、PLEKHS1)与胃癌患者生存时间呈正相关,6个基因(CST2、AADAC、SERPINE1、ASPN、ITGBL1、MAP7D2)与胃癌患者生存时间呈负相关。对6个结直肠癌芯片数据集进行整合分析,得到990个差异基因,对TCGA结肠癌测序数据进行分析,得到4131个差异基因,对这些差异基因取交集,最终共得到885个共同差异基因(458个下调基因,427个上调基因)。GSEA富集分析显示,有32条信号通路出现在3个或3个以上的数据集中,包括9条激活通路和23条抑制通路。生存分析得到7个基因构建预后模型,5个基因(AXIN2、CXCL1、ITLN1、CPT2、CLDN23)与结直肠癌患者生存时间呈正相关,2个基因(TIMP1、LZTS3)与结直肠癌患者生存时间呈负相关。2.白花蛇舌草抗胃肠道癌作用机制的网络药理学分析结果在白花蛇舌草抗胃癌作用机制的网络药理学研究中,对“化合物-化合物靶点网络”、“化合物靶点蛋白互作网络”、“胃癌蛋白互作网络”、“化合物靶点-胃癌靶点蛋白互作网络”的综合分析显示,碳酸酐酶、p53、PIK3CA可能是白花蛇舌草的关键靶点,白花蛇舌草与细胞周期、细胞凋亡、血管新生相关的蛋白,如CDK2、p27Kip1、cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、p53、AKT1、BCL2、MAPK1、VEGFA、PIK3CA 等存在较强的联系。GO富集和KEGG通路富集分析显示,白花蛇舌草所调控的核心蛋白显著富集在核苷酸切除修复、细胞凋亡、细胞周期、PI3K-Akt-mTOR信号通路、VEGF信号通路、Ras信号通路等生物学过程和信号通路。通过与胃癌整合基因表达谱分析中差异基因KEGG通路富集分析的结果进行综合分析,发现二者共有的KEGG通路有5条,分别为细胞周期、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、粘着斑、TNF信号通路。在白花蛇舌草抗结直肠癌作用机制的网络药理学研究中,对“化合物-化合物靶点网络”、“结直肠癌蛋白互作网络”、“化合物-结直肠癌靶点蛋白互作网络”的综合分析得到白花蛇舌草作用于结直肠癌的10个潜在核心靶点,分别为HRAS、PIK3CA、KRAS、p53、APC、BRAF、GSK3B、CDK2、AKT1、RAF1。GO富集分析显示,白花蛇舌草所调控的核心靶点显著富集在肽基-丝氨酸磷酸化、ERBB2信号通路、Ras蛋白信号转导等生物过程。KEGG通路富集分析显示,白花蛇舌草所调控的核心靶点主要参与结直肠癌、癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等信号通路。通过与结直肠癌整合基因表达谱分析中GSEA富集分析的结果进行综合分析,发现二者共有的KEGG通路有4条,分别为MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、Rap1信号通路、胰岛素信号通路。研究结论本研究综合运用网络药理学和整合基因表达谱分析方法,在系统层面揭示了白花蛇舌草抗胃肠道癌的活性成分、作用靶点和信号通路,初步阐释了白花蛇舌草抗胃癌的作用机制可能与其协同调节与胃癌的主要病理过程如细胞凋亡抵抗、细胞周期失调、细胞分化异常、细胞增殖失控、细胞迁移、细胞侵袭、血管新生等密切相关的信号通路有关,白花蛇舌草抗结直肠癌的作用机制可能与其协同调节结直肠癌中多个常见突变基因的表达有关。本研究有助于为理解、评价中医药在治疗复杂疾病中的协同作用及促进网络药理学方法在探索抗癌中药潜在作用机制中的应用提供线索和思路。然而,由于本研究是基于数据分析开展的,因此需要进一步的生物学实验来验证本研究的结果。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：

本研宄纳入的９个胃癌芯片数据集基本信息如表１所示。首先，通过ＲＲＡ方法对??９个芯片数据集进行整合分析，得到４１１个差异表达基因，包括２３４个下调基因和１７７??个上调基因（图２Ａ）。其次，对ＴＣＧＡ胃癌测序数据进行分析，得到４６２３个差异表达??基因，包括２２１９个下调基因和２４０４个上调基因。最后，对这些差异基因取交集，最终??共得到２６８个共同差异基因，包括１４９个下调基因和１１９个上调基因（图２Ｂ，图２Ｃ，??表２）。??４１??

基于网络药理学的白花蛇舌草治疗胃肠道癌作用机制研宄??３．２功能富集分析??ＧＯ富集分析显示，下调的差异基因显著富集在多种与代谢相关的生物过程，而上??调的差异基因与细胞外基质密切相关，如细胞外基质组织、细胞外基质分解、细胞外基??质结构成分等（图３Ａ）。??ＫＥＧＧ通路富集分析显示，下调的差异基因显著富集在多种与代谢相关的信号通路，??如药物代谢－细胞色素Ｐ４５０、细胞色素Ｐ４５０异生素代谢、视黄醇代谢、酪氨酸代谢等，??而上调的差异基因显著富集在与环境信息处理和肿瘤演进相关的通路，如细胞因子－细??胞因子受体相互作用、ＥＣＭ－受体相互作用、粘着斑等（图３Ｂ）。??Ａ?Ｂ??

ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ?ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒ，ＴＰＸ２?）、ＴＩＭＰ?基质金属蛋白酶抑制剂?１?（?ＴＩＭＰ??ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?１，ＴＩＭＰ１）（表?３）。此外，通过?ＭＣＯＤＥ?对蛋白互作网络进行??模块分析，筛选打分值最高的前３个模块作为该网络的核心聚类模块（图４Ｂ，４Ｃ，４Ｄ）。??本研究发现，除了?ＣＸＣＬ８之外其余９个潜在核心基因都出现在这３个核心聚类模块中，??这意味着这３个模块在很大程度上代表了该蛋白互作网络的关键生物特征，同时这９个??基因被确认为该蛋白互作网络的核心基因（图５）。??ＧＯ富集分析显示，模块１与有丝分裂核分裂、细胞分裂、有丝分裂胞质分裂、中??间体、中心体、细胞核密切相关；模块２与胶原分解代谢过程、胶原纤维组织、细胞外??基质结构成分、血小板衍生生长因子结合、内质网腔、胶原三聚体密切相关；模块３与??细胞外基质分解、细胞外区域、细胞外空间密切相关（图６Ａ）。ＫＥＧＧ通路富集分析显??示，模块１中的基因显著富集在Ｐ５３信号通路、细胞周期、ＦｏｘＯ信号通路；模块２中??的基因显著富集在ＥＣＭ－受体相互作用、粘着斑、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信号通路；模块３中的基因??显著富集在Ｔｏｌｌ样受体信号通路、ＴＮＦ信号通路（图６Ｂ）。本研究的数据显示，某些差??异基因的过表达可能会影响它们所参与的信号通路中的正常调控。例如，胃癌组织中过??表达的Ｃ０Ｌ１Ａ２、Ｃ０Ｌ１Ａ１、Ｃ０Ｌ４Ａ１可能会导致ＥＣＭ－受体相互作用、粘着斑、ＰＩ３Ｋ－??Ａｋｔ信号通路的失调，而ＳＰＰ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９的过表达可能会导致Ｔｏｌｌ样受体信号??通路的失调。此外

本文编号：2865362