基于表观遗传改变和Notch通路的养肺活血方抗肺成纤维细胞表型转化研究

发布时间：2020-11-04 07:39

　　 研究背景与目的肺纤维化是弥漫性间质性肺疾病的简称,以细胞外基质进行性沉积,肺组织结构破坏,影像学下可见肺组织出现蜂窝状改变,肺功能逐步丧失的病理过程为特点。以α-平滑肌肌动蛋白(a smooth muscle actin,α-SMA)高表达为特征的肌成纤维细胞的形成是肺纤维化的核心环节。肌成纤维细胞主要来源于原位成纤维细胞的激活转化和上皮间质转化(EMT)两种途径,因而阻断肌成纤维细胞形成的途径,有望为肺纤维化的治疗带来新策略。由于肺纤维化目前尚无完全有效的西医治疗药物,传统的抗炎、抗氧化、抗纤维化药物均无法带来实质性临床疗效,靶向药物的研究是目前肺纤维化治疗的新方向,凸显出肺纤维化机制研究的重要性。中医药对肺纤维化的防治有其独特性,辨证论治以及辨病论治相结合的防治思路在临床上收到良好疗效,可减轻疾病带来的痛苦、提高病人生活品质、延长生命周期等,然而中药组方多变、成分复杂,阻碍了中医药治疗肺纤维化的广泛应用。因此,精选临床对本病确切有效、理论依据可靠的中药复方为基点加以深入研究,具有重要理论意义和临床实用价值。养肺活血方是临床多年应用的验方,具有良好的治疗肺纤维作用,对其作用机制的探讨既往已有较多成果。所以,本论文在教育部博士点基金研究基础上,依托国家自然基金项目,主要围绕肺成纤维细胞-肌成纤维细胞激活转化以及中药复方养肺活血方在表型转化中的作用进行研究。肺纤维化发病及致死率高,对其发病机制及治疗方法的研究历来是医学研究的热点之一。有关肺纤维化的研究中西医已有大量报道,新的进展和成果令人瞩目。因此,论文第一部分着手于文献整理,分别对肺纤维化、肌成纤维细胞(MFB)表型转化的西医研究进展进行综述,从分子、基因层面详述其病因病机,为中药干预的机制探讨奠定基础。此外,对中医学对肺纤维化理法方药的研究进展进行综述,阐明中医药治疗肺纤维化的理论基础。有效方药的机制探讨是肺纤维化研究的核心环节,故论文第二部分重点探讨养肺活血方在肌成纤维细胞转化中的干预作用及调控机制。研究方法1、以全基因组甲基化测序及功能分析的方法,观察模型组和养肺活血方组对其的影响。采用博来霉素(BLM)气管一次性给药复制大鼠肺纤维化动物模型,正常组大鼠不造模处理。正常组和模型组大鼠生理盐水灌胃14天、养肺活血方组按剂量灌胃养肺活血方浓缩液14天,14天后处死大鼠并取肺组织。HE染色、Masson染色、电镜实验综合反映大鼠肺纤维化造模是否成功,然后采用全基因组甲基化亚硫酸盐法测序(WGBS)的方法对正常组、模型组、养肺活血方用药组肺组织进行全基因组甲基化测序及功能分析。2、在大鼠原代细胞肺纤维模型基础上,观察养肺活血方对肌成纤维细胞功能的影响。采用大鼠肺组织原代培养并纯化得到肺成纤维细胞(FB),转化生长因子-β1(TGF-β1)造模使肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞;同时制备养肺活血方兔含药血清。以体外细胞实验的方法,免疫荧光定性检测αa-SMA荧光的表达位置及强度、Western Blot定量测定α-SMA蛋白表达、胶原收缩直观反映肌成纤维细胞收缩能力的改变。3、以体外细胞实验的方法,从Notch信号通路研究养肺活血方对肌成纤维细胞转化的影响。采用Western Blot检测Notch受体、配体及下游效应基因的改变、采用免疫共沉淀方法反映Notch胞内段(NICD1)与核内效应蛋白CSL结合情况、采用慢病毒转染Notchl目的基因至成纤维细胞并检测养肺活血方不同剂量用药后细胞内COL-I的表达。4、以液质联用法检测养肺活血方主要成分。按养肺活血复方剂量比例称取中药材,醇提得到复方总成分,采用液质联用方法对养肺活血方进行成分检测分析。研究结果1、对不同染色体进行甲基化水平分析,可以看出不同样本不同染色体甲基化水平存在差异,空白、模型、养肺活血方三组CG区域甲基化差异不大,主要差异性基因在CHG、CHH。对不同样本基因组不同功能区域的甲基化信息进行聚类分析,可以很清晰看出空白、模型、养肺活血方三个组甲基化状态存在差异,同时养肺活血方与空白组有更多相似性,说明养肺活血方具有调控DNA甲基化的作用。2、采用TGF-β1(5ng/mL)处理成纤维细胞24小时能够诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,表现为免疫组化α-SMA 阳性表达,且TGF-β1处理组细胞纤维丝明显。养肺活血方含药血清作用后,可以明显抑制成纤维细胞-肌成纤维细胞转化,α-SMA、COL-I、COL-III表达降低,且胶原收缩受到抑制。3、养肺活血方含药血清无论高、中、低剂量均可降低Notch受体Notchl、Notch3,配体Jaggedl、DLL4,下游效应蛋白CSL表达;免疫共沉淀说明含药血清可以降低Notchl胞内段NICD1入核与CSL结合,阻断下游产物的生成;转染Notchl病毒的成纤维细胞COL-I含量升高,养肺活血方含药血清作用后成纤维细胞COL-I表达明显降低。4、中药复方含有单味药有效成分,实验与7个标品对照,共检测到儿茶素、阿魏酸、白藜芦醇苷、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、丹酚酸B、五味子乙素和异欧前胡素等成分。研究结论1、养肺活血方能够调控DNA甲基化。2、养肺活血方含药血清能够抑制由TGF-β1诱导的肌成纤维细胞的活化;养肺活血方含药血清能够抑制Notch信号通路的活化,对成纤维细胞-肌成纤维细胞表型转化进行调控。主要创新之处1、采用高通量全基因组甲基化测序及功能分析的方法,从基因层次探讨了养肺活血方对肺纤维化基因甲基化的干预作用,为后续更深入的研究奠定了良好基础。2、以Notch信号通路为着眼点,在大鼠原代细胞肺纤维化模型基础上,从影响肺成纤维细胞表型转化的角度,深入揭示了养肺活血方多靶点效应的主要作用机制。3、采用液质联用技术,首次对临床验方养肺活血方进行了成分分析,明确了该方的主要有效成分,为肺纤维化的临床中药研究提供了可靠依据。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ?Ｇｏｌｄ?Ｋｉｔ，?Ｚｙｍｏ?Ｒｅｓｅａｒｃｈ），经过处理，未发生甲基化的Ｃ变成Ｕ（ＰＣＲ扩增后??变为Ｔ），而甲基化的Ｃ保持不变，最后进行ＰＣＲ扩增，得到最终的ＤＮＡ文库。文库构建??流程图如下（图１．１）：??ｍｅ?ｎｅ??Ｉ?Ｉ??？？ＧＣＧＧＣＡＴＧＩＴＴ?ＡＡＡＣＧＧ?Ｗ??３…＂ＧＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＧ＾？？…．５??Ｆｒａｙｎｅｎｔａｔｌｏｎ??Ｉ?Ｊ?ｉ??ＵＣＧＧＣＡ了?ＧＴＴＴＡＭＣＧＣＴ？？…？玄??３－？．．？ＧＧＣＣＧ?ｔＡＣ?ａａａｔｔｔ?ｇｃ?ＧＡ?５??Ｆｉｌｌ?ｉｎ?＆?ａｄｄ?Ａ??ｍｅ?＼ｊ?ｍ＆??＾？？？？？？ＣＣ?ＧＧＣＡＴＧ?Ｔ?Ｔ?ＴＡ／ＶＣＧＣ?Ｔ??Ａ＾ＧＧＣＣＧ丁?ＡＣＡＭＴＴＴＣＸＧＡ—ｓ??Ａｄａｐｔｏｒ?ｌｉｇａｔｉｏｎ??ｍｅ?ｉｊ?ｒｎｅ??５？．．．．ＣＣ６ＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＴ．．，－＾３?—??３Ａ．？．，．Ｇａ：ＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＯ：Ｇ４ｓ??Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??Ｖ??ｍｅ?ｒｒ＜ｅ??ｆ？￣?Ｉ?１?ｆｓＴ??ｗｍｍｍｍｍｍｍ?：Ｔ．ＵＵＧＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＵＴ．．－．＾Ｊ????■??ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??＜）＾——．．．．?—??ｓＴ？．．．．ＴＴＧＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＴ．．．＿．ｓ?ｉ?旧―獨??，Ａ＿．．．ＡＡＣＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＡＡ．．．．．．Ｓ??图１．?１文库构建流程图??Ｃ．

向互补）的转化，将转化后的测序结果和基因组分别进行两两比对，将所有的比对结果输??出。??Ｂｉｓｍａｒｋ比对的基本思路如下图１．３所示：??⑴将基因组序列和测序ｒｅａｄ分别作Ｃ－ｔｏ－Ｔ和Ｇ－ｔｏ－Ａ转换；??（２）

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本文编号：2869827