目的:在体与离体实验相结合,探索甘参复方对胆汁淤积型肝纤维化大鼠肝纤维化程度的影响。同时,通过观察甘参复方对肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)活化程度、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,p-ERK)和核转录因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)表达的影响,揭示甘参复方抗肝纤维化的机制。方法:1.体内实验:大鼠随机分为假手术组、模型组、甘参复方组,采用胆总管结扎法(bile duct ligation,BDL)制备胆汁性肝纤维化大鼠模型,在2周、4周两个时间点取材。甘参复方组按前期实验确定给药剂量(25mg·kg~(-1))。通过HE染色观察肝组织形态学变化,Masson染色观察肝脏纤维组织再生情况,酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA)检测肝组织肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)表达,免疫印迹法(Western blot)检测肝组织内Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,Col.Ⅰ)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平的变化。2.体外实验:离体培养永生化大鼠肝星状细胞株HSC-T6(表现为活化型),观察甘参复方对HSC-T6活化的影响及其机制:(1)将甘参复方稀释成6个不同的浓度梯度,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,筛选出甘参复方对HSC-T6的最佳作用浓度。(2)将细胞分为正常对照组,甘参复方低、中、高浓度组,采用ELISA法检测各组细胞上清液中的Col.I含量。为了进一步验证甘参复方对HSC-T6的活化影响,应用2ng·ml~(-1)转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激HSC-T6,将细胞分为5组,即正常对照组、TGF-β1组和TGF-β1+甘参复方低、中、高浓度组,应用CCK-8法检测甘参复方对HSC-T6增殖的影响。用用免疫荧光法检测HSC-T6中的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;Western Blot法检测各组HSC-T6中p-ERK和NF-κB的表达。并且用ERK抑制剂PD98059和激动剂血小板衍生生长因子BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)作用于HSC-T6,从不同角度观察甘参复方对p-ERK表达的影响。结果:1.甘参复方显著抑制胆汁性肝纤维化大鼠肝组织的纤维组织生成:(1)HE染色显示,胆总管结扎2周后,肝细胞变性坏死,胆小管显著增生,门管区伴随大量炎症细胞浸润。4周后,肝细胞广泛变性坏死,胆小管增生更加显著,门管区周围和坏死区域大量纤维组织增生。增生的纤维组织相互连接,形成“假小叶”。甘参复方能够在2周、4周明显抑制肝组织纤维增生,缓解肝脏结构紊乱以及炎症细胞浸润。(2)Masson染色显示,假手术组大鼠,仅在肝中央静脉和汇管区周围有少量纤维组织。胆总管结扎2周后,纤维组织显著增生。胆总管结扎4周后,增生的纤维组织相互连接,形成“假小叶”。甘参复方在2周和4周可以显著抑制纤维组织再生。(3)ELISA结果显示,胆总管结扎2周和4周以后,肝组织TNF-α和IL-1β含量显著增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.01,P0.001)。与模型组比较,甘参复方组肝组织TNF-α和IL-1β合成减少,有显著统计学差异(P0.001)。(4)Western blot结果显示,2周和4周以后,模型组肝组织Col.Ⅰ和P-ERK合成显著增加,与假手术组比较有显著统计学差异(P0.001)。甘参复方在2周和4周能够显著抑制Col.Ⅰ和p-ERK合成,与模型组比较有统计学意义(P0.05,P0.01)。2.甘参复方可抑制HSC-T6活化以及ERK通路的磷酸化:(1)甘参复方作用24h后,0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μmol·L~(-1)6个浓度药物对细胞生长有抑制作用,与正常对照组相比,具有统计学意义(P0.05)。于此基础上筛选甘参复方低(0.125μmol·L~(-1))、中(0.25μmol·L~(-1))、高(0.5μmol·L~(-1))三个浓度组。(2)ELISA结果显示,0.125、0.25、0.5μmol·L~(-1)的甘参复方能够抑制HSC-T6分泌Col.Ⅰ,其中0.5μmol·L~(-1)与对照组相比有统计学差异(P0.05)。(3)TGF-β1显著诱导HSC-T6细胞增殖,与正常对照组相比,有显著统计学意义(P0.001),甘参复方中、高浓度能明显抑制TGF-β1诱导的细胞增殖(P0.05)。(4)经TGF-β1刺激后的细胞上清Col.Ⅰ含量以及胞内α-SMA生成显著增加,与对照组比较,有显著统计学差异(P0.01)。与TGF-β1组对比,3个浓度甘参复方均能减少胶原合成和α-SMA生成(P0.05,P0.01)。(5)甘参复方对活化肝星状细胞NF-κB/ERK信号通路活化有下调作用:与正常对照组比较,甘参复方低、中、高浓度组的细胞磷酸化ERK和NF-κB表达均显著减少,有明显统计学差异(P0.05,P0.01,P0.001)。PDGF-BB刺激后细胞p-ERK蛋白的表达升高(P0.05),PD98059可抑制PDGF-BB诱导的ERK磷酸化。低、中、高3个浓度甘参复方组均可下调PDGF-BB诱导的ERK磷酸化,与PDGF-BB刺激组比较,有显著统计学意义(P0.001)。结论:1.甘参复方能够改善肝脏组织形态结构,抑制胶原纤维增生,减轻肝脏炎症反应,从而达到抗纤维化作用,其机制可能是通过抑制ERK磷酸化,从而抑制HSC增殖。2.甘参复方能够抑制HSC-T6增殖、α-SMA和Col.Ⅰ的表达,提示甘参复方抗纤维化的内在机制之一可能是抑制肝星状细胞的活化。3.甘参复方能够抑制NF-κB的表达,且能够下调HSC-T6中ERK磷酸化水平,提示甘参复方通过抑制NF-κB表达,从而抑制炎症反应以及由炎症激活的ERK通路,继而抑制HSC活化和增殖。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
肝组织大体观察
如图2所示,假手术组肝组织形态结构正常,肝细胞围绕居中的中央静脉向四周呈放射状排列,肝小叶周围的汇管区仅见少量成纤维细胞(见图2-A)。胆总管结扎2周,模型组肝组织可见肝小叶之间界限不明显,肝索排列疏松紊乱,汇管区周围成纤维细胞增多,间质有少量淋巴细胞浸润,胆管上皮细胞及小胆管增生,增生的纤维组织延伸至肝小叶内,部分肝细胞被增生的纤维包绕,肝窦增宽(见图2-B)。甘参复方组(2周)显示,与模型组比较,肝小叶破坏、胆小管增生以及纤维增生等肝组织损害程度均有所改善(见图2-C)。造模4周后,模型组肝小叶结构严重破坏,大量炎症细胞浸润,伴随弥漫性的胆小管增生。同时,增生的纤维组织深入肝小叶内,并分割肝小叶,形成大量“假小叶”(见图2-D)。甘参复方组(4周)可见肝组织结构、胶原纤维增生范围较模型组明显减轻,仍可见部分炎症细胞浸润(见图2-E)。1.3 各组大鼠肝组织Masson染色结果
如图3所示,肝脏中的胶原纤维染色后为蓝色。显微镜下,假手术组肝组织形态结构正常,肝索、肝窦清晰,仅在肝汇管区见少量胶原纤维(见图3-A)。模型组(2周)大鼠肝组织汇管区周围和肝小叶内可见增多的胶原纤维(见图3-B)。胆总管结扎4周以后,中央静脉以及汇管区的纤维条索向外延伸、相互交联,肝小叶结构被延伸的胶原纤维分割破坏,形成假小叶(见图3-D)。甘参复方组(2周)肝脏纤维增生较模型组减轻(见图3-C),甘参复方组(4周)肝组织的结构紊乱减轻,增生的胆管以及纤维组织增生较模型组(4周)明显减少(见图3-E)。分析CVF发现,模型组(2周)CVF与假手术组相比,差异显著(P<0.001);甘参复方组(2周)的CVF与模型组(2周)相比,明显减少,有明显统计学意义(P<0.05);模型组(4周)CVF与假手术组相比,显著增加(P<0.001);甘参复方给药4周后,CVF与模型组(4周)显著减少(P<0.001)。(见表3)2. 甘参复方对肝组织TNF-α的影响
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本文编号：
2871494
