松子蛋白调控Nrf2信号通路保护神经元作用及其机制研究

发布时间：2020-11-05 20:44

　　 目的:探讨松子蛋白保护神经元作用及机制。方法:(1)利用盐析法提取松子蛋白,利用SDS-PAGE检测松子蛋白的分子量范围,利用全自动氨基酸分析仪分析松子蛋白氨基酸组成与含量;(2)体外实验:利用过氧化氢(H_2O_2)建立SH-SY5Y细胞氧化损伤模型。分为空白对照组,模型对照组,松子蛋白低剂量给药组、松子蛋白中剂量给药组、松子蛋白高剂量给药组通过MTT比色法检测松子蛋白对SH-SY5Y细胞存活率的影响,利用流式细胞术检测松子蛋白对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,利用Western blotting技术检测SH-SY5Y细胞内Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1、Aβ_(1-42)蛋白的表达水平,利用RT-PCR技术检测小鼠神经细胞中中Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1基因的表达水平;(3)体内实验:选取ICR种小鼠,采用血管性痴呆模型小鼠,分为假手术对照组、模型对照组、阳性给药组、松子蛋白低剂量给药组、松子蛋白中剂量给药组、松子蛋白高剂量给药组,利用Morris水迷宫与跳台实验对小鼠进行行为学检测,采用SOD、MDA、GSH生化试剂盒检测松子蛋白对小鼠海马抗氧化能力影响,HE染色观察松子蛋白对小鼠海马神经元形态的影响,TUNEL染色法检测松子蛋白对小鼠海马神经元凋亡的影响,采用Western blotting技术检测小鼠脑组织中Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、Keap1、Aβ_(1-42)蛋白的表达水平。结果:(1)松子蛋白主要分布在3.3~14.4KDa和20.1~25KDa,松子蛋白含有7种必需氨基酸、10种非必需氨基酸;(2)松子蛋白能提高H_2O_2所致SH-SY5Y细胞损伤的存活率(P0.05),抑制SH-SY5Y细胞的细胞凋亡(P0.05);(3)松子蛋白能减少血管性痴呆模型小鼠逃避潜伏期和逃避路程(P0.05),增加其脑组织中GSH和SOD的水平(P0.05),降低脑组织中MDA的含量(P0.05),松子蛋白能维持小鼠海马神经元的完整性和排列紧密度,抑制核固缩,减少小鼠海马区神经元的凋亡,体外与体内实验均证明松子蛋白可上调神经细胞内Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白的表达水平(P0.05),下调神经细胞内Aβ_(1-42)、Keap1和Bax蛋白的表达水平(P0.05)。结论:松子蛋白可能通过促进Nrf2信号通路的传导,上调Nrf2、HO-1、Bcl-2的表达水平,下调Aβ_(1-42)、Bax的表达水平,抑制氧化损伤和神经元的凋亡,从而起到神经元的保护作用。
【学位单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

Ada)Maker PEBMaker图 1-1 SDS-PAGE 电泳结果图（A.Maker 10~180KDa B.Maker 3.3~31KDa）如图 1-1（A 和 B）结果显示：松子蛋白分子量在 3.3~55KDa 之间。可分为四个区间部分：3.3~14.4KDa，20.1~25KDa，31~35KDa，40~55KDa；其中蛋白质主要分布在 3.3~14.4KDa 和 20.1~25KDa。3.2 氨基酸分析结果表 1-1 松子蛋白氨基酸组成必需氨基酸 含量（%）Thr 2.023Val 2.422Met 1.748

提取总蛋白 6 孔板培养细胞，按照 2.2 法进行分组给药，胰酶消化后 PBS 洗 3 次细50μL/孔 RIPA 裂解液，冰浴裂解 45min，后将裂解液转移至 EP 管中~14,000g，4℃离心 3~5min，离心后取上清液，保存于-80℃冰箱中备用测定总蛋白浓度用 Easy Protein Quantitative Kit 法进行蛋白浓度的测定，具体检测方法热酶标仪 30min，并将考马斯亮蓝于室温中静止 20min 后，分别于 96入 0、1、5、7、9、10μL 牛血清蛋白标准溶液（0.22mg/mL），且每孔水补至体积为 10μL，每孔加入 100μL 考马斯亮蓝染液并于摇床震摇，在 595nm 波长下，测定不同组别蛋白样本的 OD 值，计算出蛋白标准y=0.883x-0.1705，R2=0.9946（y 轴为浓度 C，x 轴为 OD 值）。标准曲图 2-1。

PEH图 2-2 PE 对 H2O2造模 SH-SY5Y 细胞形态的影响3.3 PE 对 H2O2致损伤的 SH-SY5Y 细胞凋亡的影响利用 AnnexinV-FITC 双染法以检测各组细胞凋亡率情况，如图 4 显示，Blank组 SH-SY5Y 细胞早期凋亡率为（31.8±0.06）%，晚期凋亡率为（1.0±0.09）%；模型组 SH-SY5Y 细胞早期凋亡率为（55.4±0.12）%，晚期凋亡率为（7.3±0.15）%；PEL 给药组早期凋亡率为（44.4±0.02）%，晚期凋亡率为（1.6±0.09）%；PEM 给药组早期凋亡率为（35.1±0.03）%，晚期凋亡率为（0.4±0.02）%；PEH给药组早期凋亡率为（34.0±0.02）%，晚期凋亡率为（0.4±0.05）%。对总凋亡率进行分析，如表 5，Blank 组总凋亡率（32.8±0.13）%，模型组总凋亡率（62.7±0.32）%，PEL 给药组总凋亡率（46.0±0.15）%，PEM 给药组总凋亡率（35.5±0.03）%，PEH 给药组总凋亡率（34.4±0.06）%；与 Blank 组比较，Model 组总凋亡率明显增加（P<0.05），与模型组比较，PE 三个给药组总凋亡率明显降
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本文编号：2872164