痰热清注射液对临床分离耐药菌的逆转作用及机制探讨
发布时间：2020-11-15 00:13
人类对抗生素的滥用,催生了超级细菌,多种无法得到有效治疗的多重耐药菌已经出现,极大威胁了人类的健康,是全人类所面临的重大问题。在2016年G20峰会上抗生素耐药性的话题已经上升到了国际高度,成为一个等同于气候变化和恐怖主义的世界性问题,虽然也有新的抗菌药物陆续研发以抵制耐药菌,但由于研究周期长、难度大、研究成本高等原因进展缓慢,更严重的是,许多抗生素还没有上市即发现耐药菌,因此单纯依靠研发新抗菌药物并不能及时有效地遏制细菌耐药的进程。所以,探讨逆转细菌的耐药性,恢复耐药菌对抗生素的敏感性是最经济、快速的应对策略。中药在现代预防和控制细菌性感染疾病方面具有重要作用。目前发现清热解毒、清热燥湿等中药具有抗菌及逆转耐药作用,如芦亚君等研究了三黄汤、黄连解毒汤和五味消毒饮三方均能使产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌部分或全部逆转恢复对抗生素的敏感性。痰热清注射液主要包括黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘,属于中药复方制剂,具有清热化痰、抗菌、增强机体免疫等作用,临床上主要用来治疗呼吸道致病菌(金黄色葡萄球菌,肺炎双球菌等)所致的呼吸道感染,其中金黄色葡萄球菌是主要致病菌。美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。随着抗生素的广泛应用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcu saureus,MRSA)数量激增,MRSA的流行是一个严重的临床医学及公共卫生问题。美国每年因MRSA感染导致死亡的患者数相当于艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)、结核病(Tuberculosis,TB)和病毒性肝炎(Viral hepatitis,AVH)的总和。我们前期的工作基础表明,痰热清具有抑制MRSA细菌生物膜的形成,与抗生素万古霉素联用有协同增效作用,但对于其能否改变MRSA的耐药性尚需进一步研究。因此在本研究中我们观察了其对于临床来源MRSA的耐药逆转作用。本研究主要分为四部分,从表型及耐药基因角度探讨了TRQ(TanReQing)对MRSA耐药逆转作用:一、表型研究-痰热清注射液对临床分离耐药菌(MRSA)的逆转作用研究本实验部分主要是用MIC(Medium Interface Connector)值表征临床分离MRSA逆转前后耐药性的变化,MIC值高表示耐药性强,反之表示耐药性变弱或非耐药,所以,使用MIC值可表示TRQ有无逆转作用。二、痰热清诱导逆转临床分离耐药菌逆转作用的遗传稳定性研究当TRQ对临床分离MRSA产生逆转作用之后,主要的问题便是其遗传稳定性研究,针对此问题,我们分别进行了连续空白培养10代和相关抗生素反复诱导5代两方面研究,根据观察MIC变化确定其遗传稳定性,若连续空白培养10代后和抗生素诱导耐药5代前后的MIC值无大的差异,证明逆转具有遗传稳定性。三、运用基因检测方法对耐药菌中抗性基因进行了机制探讨MRSA产生耐药性的原因分为获得性耐药和固有耐药,这两种来源均离不开DNA的转化或介导,即离不开相关基因的变化,所以,可以通过监测逆转前后菌株中基因的变化进行机制探讨。四、运用分子克隆技术对耐药菌中相关耐药基因进行了机制探讨基于上述对抗性基因的实验结果,我们挑选了几个耐氨基糖苷类抗生素基因运用分子克隆技术进行详细研究。结果表明,在表型实验中,其逆转后的临床分离MRSA对各临床常用抗生素MIC值较逆转前有明显的降低,特别对于氨基糖苷类抗生素尤为明显,在进一步的机制研究中,在诱导逆转前后,多种耐药基因发生变化,消失或减少。而利用分子克隆技术将相关耐药基因(aacA)引入至感受态细胞后,其表型(MICs)表现是发生增大变化的,表明临床MRSA的耐药性与此耐药基因有关。综合以上所述,痰热清注射液对临床分离MRSA具有诱导逆转作用,并通过改变部分耐药基因而使其耐药性降低,为临床耐药菌引起的细菌感染性疾病提供新的方法及思路,指导临床用药选择(提高治愈率、减少死亡率等)、优化抗菌药物的使用方法、基于机制的探讨有助于新药开发等。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285
【部分图文】：
血琼脂基础 (OXOID)。实验用抗生素具体分类如图 1.1 所示。图.1-1 实验所用抗生素分类及名称Fig. 1-1 Classification and name of antibiotics used in the experiment
A、FOX、OX、CIP、LZD、SM、P、E、RD、TE 对各原IC 值。取无菌 96 孔平底微量板，按照溶液 2 倍稀释法稀释度为 16500、 8250、 4125、 2063、 1032、 516、 258、设定阴性对照孔和阳性对照孔，其中阴性对照孔中含 200100μL LB 培养基和 100μL OD600=0.02 的菌液， 置 37孔加入 0.25% TTC 30μL，继续培养 0.5 h。 显现红色为有提下，判断药物的 MIC 值。记录结果，每次实验重复 法工作台中，挑取以上 7 株耐药菌菌株于装有 3-5mL MH 肉件的恒温震荡培养箱中培养 16-18h，培养完成后，测定其为 0.2，备用。TRQ 浓度参考前期实验选择为 4096μg/mL 稀释药液 1:1 混匀（V:V=1.5:1.5），于 280rpm、37℃条件h，最后于超净台中涂布菌液以生长（16-18h）保存菌落，，4℃保存备用。具体流程见下图。
图 1.3 MIC 值变化（临床分离耐药菌 1611017 经 TRQ 诱导逆转至 5 代）MIC value changes (clinical isolation of drug-resistant strain 1611017 was reversed generations)表 1-2 MIC 值变化（临床分离耐药菌 1611017 经 TRQ 诱导逆转至 5 代）MIC value changes (clinical isolation of drug-resistant strain 1611017 was reversedgenerations)转代数 R0 R1 R2 R3 R4 μg/mL） 512 2 256 512 512 RD
【相似文献】
本文编号：2884096
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图 1.3 MIC 值变化（临床分离耐药菌 1611017 经 TRQ 诱导逆转至 5 代）MIC value changes (clinical isolation of drug-resistant strain 1611017 was reversed generations)表 1-2 MIC 值变化（临床分离耐药菌 1611017 经 TRQ 诱导逆转至 5 代）MIC value changes (clinical isolation of drug-resistant strain 1611017 was reversedgenerations)转代数 R0 R1 R2 R3 R4 μg/mL） 512 2 256 512 512 RD
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本文编号：2884096
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