多穗柯无色花青素还原酶基因的克隆及其表达与根皮苷含量的相关性分析

发布时间：2020-11-15 02:08

　　 目的克隆多穗柯Lithocarpus polystachyus的无色花青素还原酶(leucoanthocyanidin reductase,LAR)基因,并对其表达量与根皮苷含量的关系进行分析。方法根据多穗柯转录组测序的结果(Unigene号:DN30711_c0_g1_i1),利用PCR法扩增获得多穗柯LAR基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测LAR基因的表达量,使用UPLC法测定根皮苷的含量,应用SPSS18.0软件分析LAR基因表达量与根皮苷含量间的相关关系。结果多穗柯LAR基因的cDNA全长1 053 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码350个氨基酸。该蛋白不存在跨膜区域,定位于细胞质中。多穗柯LAR蛋白属于PCBER_SDR_a家族,与栓皮栎LAR蛋白具有较高的相似性(95%),且亲缘关系最近。多穗柯的根皮苷含量与LAR基因的表达量呈正相关(P0.05)关系。结论首次克隆得到多穗柯LAR基因,并证实多穗柯根皮苷含量与LAR基因的表达量呈正相关,为揭示多穗柯中根皮苷的生物合成机制奠定理论和技术基础。
【部分图文】：

各多穗柯样品按“2.5.2”项下制备供试品溶液，以“2.5.3”项色谱方法进行测定，记录峰面积，代入回归方程，计算各样品中根皮苷含量。根皮苷对照品及样品1的UPLC色谱图见图1。3 结果与分析

在线软件ProtParam分析的结果显示，多穗柯LAR蛋白质的理论等电点（pI）为5.32，为酸性蛋白；相对分子质量为38 647.18；在体外红细胞中的半衰期为30 h，不稳定指数为35.30，属于稳定蛋白；亲水性的平均值为-0.085，属于亲水性蛋白；脂肪系数为93.89，富含异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、天冬氨酸（Asp）。SOMPA软件对LAR基因编码的蛋白质的二级结构分析显示，该蛋白含α螺旋（alpha helix)121个，占34.57%；延伸链（extended strand)70条，占20%；β转角（beta turn)20个，占5.71%；无规卷曲（random coil)139个，占39.71%。PROSITE程序预测该蛋白具有1个NAD(P）结合位点和1个赖氨酸活性位点。对保守结构域分析表明，该蛋白属于PCBER＿SDR＿a家族。结合同源建模的方法，以3i52.1.A为模板蛋白，运用SWISS-MODEL在线软件对多穗柯LAR蛋白的三级结构进行预测，结果表明LAR蛋白以无规卷曲和α螺旋为主，兼有少量的延伸链和β转角，与二级结构的预测结果基本一致。TargetP 1.1 Server在线工具分析，多穗柯LAR定位于细胞质中，预测可靠性等级为5.14，而且SignalP 3.0 Server在线分析表明，多穗柯LAR基因编码的蛋白质不存在信号肽。经过对多穗柯LAR氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，结果显示多穗柯LAR基因编码的多肽不存在跨膜区。

将多穗柯LAR与GenBank中登载的19种其他物种的LAR蛋白进行聚类分析，构建LAR的系统进化树，结果见图3。在双子叶植物内部，多穗柯LAR蛋白与同为壳斗科的栓皮栎Quercus suber L.亲缘关系最近，首先聚为一支，支持率达97%，随后与杨柳目的黑杨Populus nigra Linn.、鼠李目的枣Ziziphus jujube Mill.、蔷薇目的苹果Malus domestica Mill.、锦葵目的可可等聚为一个大分支，与桃金娘目的大桉Eucalyptus grandis Hill ex Maiden亲缘关系较远，与外类群人、原生生物格氏奈氏菌（Naegleria gruberi strain NEG-M）、假单胞菌病毒D3(Pseudomonas virus D3）和阴沟肠杆菌复合体SP.Enterobacter cloacae complex sp.分别聚为一个分支，这与传统的分类结果相符，也暗示了多穗柯LAR基因与其他植物的LAR基因具有共同的进化起源。3.4 多穗柯LAR基因的表达及其与根皮苷含量的相关性分析
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