柴胡多炔RB-2和RB-4的代谢研究

发布时间：2020-11-19 12:26

　　 选题依据:抑郁症是一种慢性复发性情绪障碍,是全球常见的疾病之一。目前,治疗抑郁症以西药为主,但临床用药中常出现毒副作用大及耐受性差等问题,从作用温和、毒副作用小的中药中研发理想的抗抑郁药物成为研究热点。本课题组在前期研究中已明确源自逍遥散君药柴胡中的多炔类成分具有抗抑郁活性,且大鼠体内药动学实验表明含量较高的柴胡多炔RB-2和RB-4在体内呈现出吸收较快消除较慢的特征,在体外单胺递质再摄取抑制活性测试中均表现出较强的抑制活性,有望开发为抗抑郁新药。因此,探寻柴胡多炔RB-2和RB-4的体内外代谢特征、参与代谢过程的代谢酶的类型及与CYP450代谢酶活性的关系等体内外代谢特征成为必不可少的研究内容。通过研究具有适宜药代动力学参数的候选化合物体内外代谢特征,分析并鉴定其代谢物,阐明代谢途径,尽可能明确药物及代谢物的药理及毒理作用,为研发降低成本,也为后期临床安全用药提供科学依据。目的:明确柴胡多炔RB-2和RB-4体内外代谢特征,阐明其代谢途径,探寻介导柴胡多炔生物转化的CYP450酶,并研究柴胡多炔对CYP450酶活性的影响,通过上述研究综合评价柴胡多炔的代谢特征,为后期抗抑郁新药的开发提供科学依据。方法:1.正常雄性ICR小鼠随机分成空白对照组和2个给药组,灌胃给予小鼠剂量均为100 mg·kg-1的柴胡多炔RB-2和RB-4,收集小鼠空白生物样品及血清、尿液、粪便和胆汁,生物样品的数据采集采用RSLC-Q Extractive Orbitrap-MS分析技术,并结合Compound Discoverier代谢分析软件对样品进行分析。通过分析柴胡多炔原型及代谢物的一级质谱和二级质谱裂解规律,推测柴胡多炔在正常小鼠体内的代谢途径。2.将RB-2和RB-4分别加入鼠和混合人肝微粒体温孵体系中共孵育,运用与研究体内代谢物相同的方法分析检测其生物样本,推测柴胡多炔在鼠和混合人肝微粒体共孵育体系中的Ⅰ相和Ⅱ相代谢途径,并考察柴胡多炔在体内外及种属间代谢特征的差异。3.针对柴胡多炔在混合人肝微粒体中主要代谢途径,采用专属性化学抑制剂法,在正常的混合人肝微粒体孵育体系中加入FDA推荐的CYP450酶各亚型专属性化学抑制剂α-萘黄酮(CYP1A2)、舍曲林(CYP2B6)、孟鲁司特(CYP2C8)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、噻氯匹定(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、氯美噻唑(CYP2E1)和酮康唑(CYP3A4),探寻各代谢物的生成抑制率,初步推测介导柴胡多炔生物转化的CYP450酶;同时采用人源重组CYP450单纯酶法,分析其在人源重组CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4单纯酶中在各代谢物生成的贡献率,进一步推测介导柴胡多炔生物转化过程的CYP450酶。结合两种方法确定介导柴胡多炔生物转化的CYP450酶的亚型。4.建立基于UHPLC-MS/MS技术的各亚型CYP450酶探针底物定量分析方法,采用MRM扫描模式,对采集数据进行分析,评价柴胡多炔对CYP450酶活性的影响。通过分析在鼠肝微粒体共孵育体系中探针底物非那西丁(CYP1A2)、依法韦仑(CYP2B6)、紫杉醇(CYP2C8)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、右美沙芬(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)和睾酮(CYP3A4)反应抑制率,初步研究柴胡多炔对7种CYP450酶活性的影响。结果:1.通过与空白对照组样品比较,鉴定出在小鼠体内,柴胡多炔RB-2共产生13种代谢物,主要存在于血清2h和粪便样品中。根据推测出的代谢物结构,按其被代谢的程度,可将Ⅰ相代谢中发生的氧化反应的类型分为如下3种;氧化(M1)、脱饱和+氧化(M2)和双重氧化(M3)、脱饱和+双重氧化(M4),Ⅱ相代谢通常会在Ⅰ相代谢反应发生的基础上发生结合反应,如葡萄糖醛酸结合(M8)、氧化+葡萄糖醛酸结合(M5),其他的结合反应类型为氧化+乙酰化(M6)和氧化+GSH结合(M7);柴胡多炔RB-4的体内代谢与RB-2类似,共鉴定出14种代谢物,主要存在于血清2h和粪便样品中。在Ⅰ相代谢中主要发生氧化反应,出现M1、M3、M4这3种类型代谢物,Ⅱ相代谢物M5、M7和M8,另外,RB-4的II相代谢中氧化+硫酸化(M9)为其特有的代谢类型。两种柴胡多炔及其代谢物均主要随粪便排出体外。2.通过与空白孵育基质比较,在与鼠肝微粒体共孵育体系中鉴定出柴胡多炔RB-2和RB-4的代谢物分别为5种和3种,其中M1、M4和M5与体内代谢物相同。同时,M11(水合+氧化+葡萄糖醛酸结合)为鼠肝微粒体系中特有。在与混合人肝微粒体共孵育体系中,柴胡多炔RB-2和RB-4的代谢类型与鼠肝微粒体中的有相似之处(M1,M4和M5),但混合人肝微粒体中出现的水合+双重氧化(M10)类型为其所特有,在鼠微粒体体系和体内生物样品中均未鉴定出。3.采用化学抑制剂法考察在HLMs中CYP450酶的亚型,结果表明,参与柴胡多炔RB-2代谢物M4、M1和M10生物转化的酶分别为CYP2C8、CYP2E1和CYP2C9;参与柴胡多炔RB-4代谢物M4、M10-1和M10-2生物转化的酶分别为CYP3A4、CYP2C9和CYP2C9。人源重组CYP450单纯酶法研究结果表明,在柴胡多炔RB-2的代谢转化中,参与代谢物M4生成的CYP450酶贡献程度大小为CYP2C9CYP2E1CYP2C8,代谢物M1的生成仅有CYP2E1参与,在M10的生成中,CYP450酶的贡献程度为CYP2C9CYP2C8;在柴胡多炔RB-4的代谢转化中,CYP450酶在代谢物M4的生成中贡献程度大小为CYP2C8CYP3A4,代谢物M10-1中其贡献程度为CYP2C9CYP2C8,代谢物M10-2为CYP2C9CYP2B6CYP2C8。结合两种方法,介导柴胡多炔生物转化的CYP450酶主要为CYP2C9和CYP2E1,CYP2B6和CYP3A4在其代谢过程中也发挥着作用。4.运用探针底物法,分析柴胡多炔对CYP450酶的影响,当探针底物反应抑制率大于50%时,初步判断化合物对CYP450酶具有抑制作用。实验结果表明,柴胡多炔RB-2和RB-4对CYP1A2的抑制程度分别为38%和24%,对CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的抑制程度均小于10%。结论:1.通过研究柴胡多炔的在小鼠体内的代谢特征,明确具有相似结构的柴胡多炔的主要代谢途径为氧化反应,葡萄糖醛酸结合反应等,主要随粪便排出体外。2.根据研究探针底物抑制结果,初步推测柴胡多炔对CYP450酶没有影响。3.通过上述研究,说明柴胡多炔的体内外代谢性质较佳,能够作为抗抑郁药物研发过程中的候选化合物进行深入研究。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

柴胡多炔 RB-2 和 RB-4 的代谢研究1.2 研究思路、技术路线图、研究内容及创新点1.2.1 研究思路、技术路线图、研究内容本课题的研究思路：本课题主要根据前期已筛选出的柴胡石油醚部位中含量较高的多炔类成分 RB-2 和 RB-4 为研究对象，首先对其进行体内代谢研究，明确其代谢途径。随后，采用体外代谢的研究方法，分析鉴定主要代谢物。进一步研究介导生成相关代谢物的代谢酶。最后，考察柴胡多炔对代谢酶的活性有影响，根据上述研究，综合评价柴胡多炔在体内外的代谢特征。本实验的技术流程图如下：

20图 3.3 RB-2 的一级质谱（A）和二级质谱（B）Figure 3.3 The MS（A） and MS2（B） positive mass spectra of RB-2柴胡多炔 RB-4 的化学结构与 RB-2 具有相似性，RB-4 准分子离子峰为[M+H]+m/z 243.1749（如图 3.4 (A)所示），一级扫描时显示出的分子离子峰，除准

22图 3.4 RB-4 的一级质谱（A）和二级质谱（B）Figure 3.4 The MS（A） and MS2（B） positive mass spectra of RB-43.4.2 柴胡多炔 RB-2 的代谢物结构鉴定将“3.3.5 生物样品数据采集”中所述 Full Scan 扫描模式采集的数据导入Compound Discoverier 2.0 软件中进行代谢物拟合，通过与空白样品比较，寻找可能
【引证文献】

相关博士学位论文 前1条

1 邢婕;柴胡质量评价方法及其对肝脏功能影响研究[D];山西大学;2018年

本文编号：2890005