阿魏酸对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及其与HIF-1α和腺苷的相关性研究

发布时间：2020-11-22 06:07

　　 目的:探讨阿魏酸(Ferulic acid,FA)对小鼠肾缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)损伤的保护作用及其可能的机制。方法:将96只雄性C57BL/6J小鼠随机分为两部分,第一部分做检测实验,将其随机分为6组,每组6只,分别为:空白对照组(Control组)、阿魏酸对照组(FA组)、模型组(IR组),低剂量阿魏酸干预组(10 mg/kg FA+IR组)、中剂量阿魏酸干预组(30 mg/kg FA+IR组)、高剂量阿魏酸干预组(100 mg/kg FA+IR组)。模型组小鼠暴露双侧肾脏后,夹闭双侧肾蒂35 min,再灌24 h;空白对照组小鼠只暴露双侧肾脏,不夹闭肾蒂;低、中、高剂量的阿魏酸干预组小鼠,提前一天分别给予10、30、100 mg/kg阿魏酸灌胃,每8 h一次,连续灌胃3次进行预处理后,再按模型组方法处理;阿魏酸对照组小鼠,提前一天给予100 mg/kg阿魏酸灌胃,每8 h一次,连续3次;然后各组小鼠同时处死,并取血及肾脏进行检测。第二部分小鼠用于七天生存率实验,分组方法同第一部分,每组10只,按上述进行肾脏暴露或阿魏酸预处理,模型组和低、中、高剂量的阿魏酸干预组小鼠的双侧肾蒂夹闭50min后,恢复灌注,每24 h观察一次小鼠生存情况,并记录,7 d后处死小鼠,绘制KM生存曲线。为了证明缺血诱导因子-1?(hypoxia inducible factor-1?,HIF-1?)在阿魏酸对小鼠肾缺血再灌注损伤中的作用,我们做了HIF-1?干扰实验。将12只雄性C57BL/6J小鼠随机分成两组,HIF-1?干扰组:FA(100mg/kg)+Ad-HIF-1?siRNA+IR组和对照组:FA(100 mg/kg)+Ad-RFP+IR组。分别用Ad-HIF-1?siRNA或者Ad-RFP转染双肾,48 h后,给予100 mg/kg阿魏酸灌胃,每8 h一次,连续3次,然后按模型组方法处理后,取小鼠血及肾脏进行检测。试剂盒检测各组血肌酐(Serum creatine,Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)含量;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肾脏病理变化情况,末端脱氧核苷酸转移的UTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidly transferased UTP nick-end labeling,TUNEL)测定法检测肾脏细胞凋亡情况;半胱天冬酶-3(Caspase-3)活性检测试剂盒检测肾脏中Caspase-3水平;流式细胞术(flow cytometry,FCM)和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)试剂盒检测中性粒细胞的浸润情况;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清炎性介质肿瘤坏死因子-?(tumor necrosis factor-?,TNF-?)和白细胞介素-1?(interleukin-1?,IL-1?)的表达;高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)检测肾脏组织中腺苷的含量;定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫印记法(western blot,WB)检测肾脏组织中HIF-1?、CD39、CD73的表达。结果:1.与空白对照组相比,模型组小鼠7天生存率明显下降,Scr、BUN水平显著升高(P0.01),小鼠肾小管损伤程度明显加重(P0.01)。2.与空白对照组相比,阿魏酸对照组的7天生存率、Scr、BUN水平、肾小管损伤程度、近曲肾小管上皮细胞凋亡情况、Caspase-3活性、中性粒细胞浸润情况、促炎细胞因子TNF-?和IL-1?及HIF-1?、CD39、CD73在mRNA和蛋白水平表达上都无统计学差异。3.与模型组相比,低、中、高剂量的阿魏酸干预组Scr、BUN水平明显降低,尤其是给药剂量为100 mg/kg时,Scr、BUN降低最明显(P0.01);从KM生存曲线看,低、中、高剂量的阿魏酸干预组的7天生存率都提高,尤其是给药剂量为100 mg/kg时,7天生存率最高,因此选择此剂量进行后期的实验分析。4.与模型组相比,高剂量阿魏酸干预组小鼠近曲肾小管上皮细胞凋亡明显减少,Caspase-3活性明显降低(P0.01),中性粒细胞浸润减少,促炎细胞因子TNF-?和IL-1?显著减少(P0.01)。5.与模型组相比,高剂量阿魏酸干预组小鼠HIF-1?、CD39、CD73在mRNA和蛋白水平都明显升高,腺苷产生也明显增加(P0.01)。6.与FA(100 mg/kg)+Ad-RFP+IR组相比,FA(100 mg/kg)+Ad-HIF-1?siRNA+IR组小鼠HIF-1?、CD39、CD73减少,腺苷产生减少(P0.01),Scr、BUN水平显著升高(P0.01),肾小管损伤程度明显加重(P0.01)。结论:阿魏酸能提高肾缺血再灌注损伤小鼠的生存率,改善肾脏功能,减轻肾小管损伤,其可能机制是通过上调HIF-1?促进内源性腺苷产生,从而减轻炎症反应。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文与- 亚基形成复合物，转移到细胞核中，通过结合缺氧标基因[28-30]。HIF-1 可通过增加血管生成因子，促进酵解的能力，调节对局部组织缺血和缺氧的适应[31-37]。小鼠中，肾 IR 损伤明显加重[38]。然而在用乙酰唑胺（的 AKI 的鼠模型中，Scr 和 BUN 水平下降，说明 HIF-9]。同时，HIF- 还直接诱导 CD73 的表达[40]，而 CD73。研究拟探讨阿魏酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用，腺苷的产生的相关机制。

27图 2. 阿魏酸对肾 IR 小鼠的 存率及肾功 的改善作 （n=6）Effects of FA on survival rate and renal function in renal IR mice ( n=6 pe-day survival curve. (B) Scr levels. (C) BUN levels. All data were expresse#P<0.01 compared with control group,**P<0.01 compared with renal IR

图 3 阿魏酸减轻肾 IR 小鼠的肾小管损伤和细胞凋亡（n=6）etreatment ameliorated renal structural damage and tubular cell aIR( n=6 per group)tative images of structure damage after renal IR on HE-stained k magnification 200. (B) Semiquantitative evaluation of kidney injuf apoptotic cells on TUNEL-stained kidney sections. (D) The caspas. All data were expressed as mean ±SD.##P<0.01 compared with**P<0.01 compared with renal IR model.减轻肾 IR 小鼠的炎症反应一步研究了阿魏酸在小鼠肾 IR 炎症反应中的作用。如图组相比，阿魏酸对照组小鼠肾组织中的炎性细胞因子 IL-1
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本文编号：2894252