8-O-乙酰山栀子苷甲酸对慢性炎性痛模型大鼠的镇痛作用机制研究
发布时间：2021-03-02 03:51
目的:研究8-O-乙酰山栀子苷甲酸（8-OaS）对慢性炎性痛模型大鼠的镇痛作用机制。方法:将30只雄性SD大鼠分为假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）和8-OaS低、中、高剂量组（3、10、30μg/kg）,每组6只。除假手术组外,其余各组大鼠足底注射弗氏完全佐剂复制慢性炎性痛模型。造模成功后,各组大鼠鞘内给予相应药物,每天1次,连续给药7 d后,采用Von-Frey细丝检测各组大鼠足底疼痛阈值,计算各组大鼠疼痛阈值曲线下面积和8-OaS的半数有效剂量（ED50）。另取36只雄性SD大鼠分为假手术组（生理盐水）、模型组（生理盐水）和8-OaS组（给药剂量为ED50）,同法造模及给药,然后采用免疫荧光组织染色法观察各组大鼠脊髓背角内离子钙结合衔接分子1（Iba-1）、磷酸化p38丝裂原激活的蛋白激酶（p-p38 MAPK）的阳性表达情况,采用Western blotting法检测各组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠足底疼痛阈值和曲线下面积均显著降低（P&...
【文章来源】：中国药房. 2020,31(13)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
各组大鼠足底疼痛阈值曲线下面积测定结果
采用免疫荧光组织染色法检测。第二批大鼠末次给药后，各组取6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速开胸，沿心尖位置扎入灌注针，打开灌注阀门用0.01 mol/L的PBS迅速冲出大鼠体内血液，待其肝脏发白时加入4%多聚甲醛固定。取出固定好的大鼠脊髓L4～L6节段，继续固定2 h后取出，置于30%蔗糖溶液中脱水48 h，在冷冻切片机中切成25μm薄片，再用PBS漂洗10 min×3次，以5%山羊血清封闭2 h；加入单克隆小鼠抗Iba-1抗体和单克隆兔抗p-p38 MAPK抗体，于4℃孵育48 h；用PBS漂洗10 min×3次，滴加Alexa Flour?594标记的驴抗小鼠IgG和Alexa Flour?488标记的驴抗兔IgG，置于室温孵育4 h；用PBS漂洗10min×3次，在暗光条件下将切片转移至载玻片上，并置于暗盒中，待表面水分自然晾干后使用荧光封片剂封片。采用多通道共聚焦显微镜观察切片中表达Iba-1、p-p38MAPK的阳性细胞，以出现红色和绿色颗粒为其阳性表达，黄色为两者双重标记的阳性表达；采用Image Pro Plus 6.0软件分析黄色区域的荧光密度，荧光密度越大则蛋白表达越强。各组大鼠脊髓背角内Iba-1和p-p38MAPK蛋白表达的免疫荧光组织染色图见图2，荧光密度测定结果见表2。由图2和表2可知，p-p38 MAPK表达阳性的细胞主要与Iba-1表达阳性的细胞（即小胶质细胞）重合。与假手术组比较，模型组大鼠脊髓背角内Iba-1和p-p38MAPK蛋白表达的荧光密度显著升高（P<0.01），表明小胶质细胞被激活；与模型组比较，8-OaS组大鼠脊髓背角内Iba-1和p-p38 MAPK蛋白表达的荧光密度显著降低（P<0.05），表明8-OaS可抑制小胶质细胞的活化。
采用Western blotting法检测。第二批大鼠末次给药后，各组取剩余6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速开胸，沿心尖位置扎入灌注针，打开灌注阀门用0.01 mol/L的PBS迅速冲出大鼠体内血液。待其肝脏发白时，于冰上迅速取出脊髓L4～L6节段，迅速分离脊髓背角，置于事先溶解有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强效裂解液中，静置10 min后采用超声组织裂解仪将组织裂解，以3 000 r/min离心5 min，取上清液进行蛋白定量。取蛋白进行变性处理，然后进行SDS-PAGE电泳分离目的蛋白条带，以PVDF转膜后采用5%脱脂奶粉封闭10 min，再依次加入小鼠抗Iba-1单克隆抗体、兔抗p38 MAPK单克隆抗体、兔抗p-p38 MAPK单克隆抗体、小鼠抗IL-6多克隆抗体、小鼠抗IL-β多克隆抗体、兔抗TNF-α多克隆抗体及小鼠抗β-actin抗体（稀释比例为1∶500），封袋后摇床振荡4 h；用TBST漂洗10 min×3次，对应加入HRP标记的驴抗小鼠IgG和HRP标记的驴抗兔IgG（稀释比例为1∶1 000），室温振荡1 h；用TBST漂洗10 min×3次，加入ECL液进行反应。采用全能型成像系统扫描条带，以β-actin或p38 MAPK为内参，采用Image Pro Plus 6.0软件分析各条带相对灰度值，用来表示目标蛋白的表达水平。各组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表达的电泳图见图3，蛋白表达水平测定结果见表3。由图3和表3可知，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，8-OaS组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。
本文编号：3058547
【文章来源】：中国药房. 2020,31(13)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
各组大鼠足底疼痛阈值曲线下面积测定结果
采用免疫荧光组织染色法检测。第二批大鼠末次给药后，各组取6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速开胸，沿心尖位置扎入灌注针，打开灌注阀门用0.01 mol/L的PBS迅速冲出大鼠体内血液，待其肝脏发白时加入4%多聚甲醛固定。取出固定好的大鼠脊髓L4～L6节段，继续固定2 h后取出，置于30%蔗糖溶液中脱水48 h，在冷冻切片机中切成25μm薄片，再用PBS漂洗10 min×3次，以5%山羊血清封闭2 h；加入单克隆小鼠抗Iba-1抗体和单克隆兔抗p-p38 MAPK抗体，于4℃孵育48 h；用PBS漂洗10 min×3次，滴加Alexa Flour?594标记的驴抗小鼠IgG和Alexa Flour?488标记的驴抗兔IgG，置于室温孵育4 h；用PBS漂洗10min×3次，在暗光条件下将切片转移至载玻片上，并置于暗盒中，待表面水分自然晾干后使用荧光封片剂封片。采用多通道共聚焦显微镜观察切片中表达Iba-1、p-p38MAPK的阳性细胞，以出现红色和绿色颗粒为其阳性表达，黄色为两者双重标记的阳性表达；采用Image Pro Plus 6.0软件分析黄色区域的荧光密度，荧光密度越大则蛋白表达越强。各组大鼠脊髓背角内Iba-1和p-p38MAPK蛋白表达的免疫荧光组织染色图见图2，荧光密度测定结果见表2。由图2和表2可知，p-p38 MAPK表达阳性的细胞主要与Iba-1表达阳性的细胞（即小胶质细胞）重合。与假手术组比较，模型组大鼠脊髓背角内Iba-1和p-p38MAPK蛋白表达的荧光密度显著升高（P<0.01），表明小胶质细胞被激活；与模型组比较，8-OaS组大鼠脊髓背角内Iba-1和p-p38 MAPK蛋白表达的荧光密度显著降低（P<0.05），表明8-OaS可抑制小胶质细胞的活化。
采用Western blotting法检测。第二批大鼠末次给药后，各组取剩余6只大鼠腹腔注射7%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，迅速开胸，沿心尖位置扎入灌注针，打开灌注阀门用0.01 mol/L的PBS迅速冲出大鼠体内血液。待其肝脏发白时，于冰上迅速取出脊髓L4～L6节段，迅速分离脊髓背角，置于事先溶解有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强效裂解液中，静置10 min后采用超声组织裂解仪将组织裂解，以3 000 r/min离心5 min，取上清液进行蛋白定量。取蛋白进行变性处理，然后进行SDS-PAGE电泳分离目的蛋白条带，以PVDF转膜后采用5%脱脂奶粉封闭10 min，再依次加入小鼠抗Iba-1单克隆抗体、兔抗p38 MAPK单克隆抗体、兔抗p-p38 MAPK单克隆抗体、小鼠抗IL-6多克隆抗体、小鼠抗IL-β多克隆抗体、兔抗TNF-α多克隆抗体及小鼠抗β-actin抗体（稀释比例为1∶500），封袋后摇床振荡4 h；用TBST漂洗10 min×3次，对应加入HRP标记的驴抗小鼠IgG和HRP标记的驴抗兔IgG（稀释比例为1∶1 000），室温振荡1 h；用TBST漂洗10 min×3次，加入ECL液进行反应。采用全能型成像系统扫描条带，以β-actin或p38 MAPK为内参，采用Image Pro Plus 6.0软件分析各条带相对灰度值，用来表示目标蛋白的表达水平。各组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β及TNF-α蛋白表达的电泳图见图3，蛋白表达水平测定结果见表3。由图3和表3可知，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，8-OaS组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。
本文编号：3058547
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