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风湿宁对风寒湿痹证CIA模型TLR4/NF-κB信号通路的作用机制研究

发布时间:2021-11-21 12:03
  目的:通过建立风寒湿痹证胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型、大鼠模型,培养风寒湿痹证CIA模型大鼠膝关节滑膜组织中成纤维样滑膜细胞(FLS),应用近红外荧光活体成像技术,围绕TLR4/NF-κB信号通路,从“滑膜组织-滑膜细胞-信号通路-靶向基因”角度,多层次地整体探究风湿宁治疗类风湿关节炎(RA)的药效作用机制。方法:第一部分,不同外感致病因素对病证结合CIA模型建立的比较研究。将110只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为4组:空白对照组(10只)、CIA模型组(40只)、风寒湿痹证CIA模型组(30只)、风湿热痹证CIA模型组(30只)。采用风寒湿、风湿热外感致病因素刺激,结合牛II型胶原乳化剂诱导的方法,建立CIA模型、风寒湿痹证CIA模型、风湿热痹证CIA模型。分别采用疗效确切的验方风湿宁(18.24g·kg-1)与治痹经方乌头汤(4.9g·kg-1)、白虎加桂枝汤(10.15g·kg-1),对这三种RA模型加以治疗。运用以方测证的反证法和比较医学手段的正证法,观察模型大鼠的足掌温度、关节炎指数、关节肿胀度、血... 

【文章来源】:成都中医药大学四川省

【文章页数】:139 页

【学位级别】:博士

【文章目录】:
中文摘要
abstract
缩略词表
引言
第一部分 不同外感致病因素对病证结合CIA模型建立的比较研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验药物及试剂
            1.2.1 治痹经方
            1.2.2 风湿宁
            1.2.3 实验试剂
        1.3 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 RA大鼠模型的建立
        2.2 RA大鼠模型的分组及给药
        2.3 标本采集及指标检测
            2.3.1 大鼠一般状态观察
            2.3.2 大鼠关节炎指数评分
            2.3.3 大鼠关节肿胀度检测
            2.3.4 大鼠血清RF、ACPA含量检测
            2.3.5 大鼠踝关节组织病理学观察
        2.4 统计学方法
    3 结果
        3.1 各组大鼠一般状态的观察结果
            3.1.1 各组大鼠造模后一般状态变化
            3.1.2 各组大鼠用药治疗后一般状态变化
        3.2 各组大鼠实验期间体质量变化
        3.3 各组大鼠实验期间足掌温度变化
        3.4 各组大鼠实验期间关节炎指数变化
        3.5 各组大鼠实验期间关节肿胀度变化
        3.6 各组大鼠实验期间血清RF、ACPA含量变化
        3.7 各组大鼠踝关节组织病理学观察结果
    4 实验小结
    5 讨论
        5.1 治痹经方的选择及意义
        5.2 病证结合CIA模型的建立及评价
        5.3 风湿宁对三种CIA模型的影响
            5.3.1 风湿宁对CIA模型大鼠体质量的影响
            5.3.2 风湿宁对CIA模型大鼠足掌温度的影响
            5.3.3 风湿宁对CIA模型大鼠关节炎指数与关节肿胀度的影响
            5.3.4 风湿宁对CIA模型大鼠血清RF、ACPA的影响
            5.3.5 风湿宁对CIA模型大鼠踝关节组织病理学的影响
第二部分 近红外荧光探针在风寒湿痹证CIA小鼠模型中成像的应用研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验药物及试剂
            1.2.1 风湿宁与来氟米特
            1.2.2 实验试剂
        1.3 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 风寒湿痹证CIA小鼠模型的建立及给药
            2.1.1 小鼠热板反应筛选
            2.1.2 动物分组
            2.1.3 模型制备
            2.1.4 给药方法
        2.2 指标检测
            2.2.1 小鼠一般状态观察
            2.2.2 小鼠足掌疼痛阈值检测
            2.2.3 小鼠关节炎指数评分
            2.2.4 小鼠关节肿胀度检测
            2.2.5 近红外荧光小鼠活体成像观察
        2.3 统计学方法
    3 结果
        3.1 风湿宁对风寒湿痹证CIA小鼠模型一般状态的影响
        3.2 风湿宁对风寒湿痹证CIA小鼠模型足掌疼痛阈值的影响
        3.3 风湿宁对风寒湿痹证CIA小鼠模型关节炎指数的影响
        3.4 风湿宁对风寒湿痹证CIA小鼠模型踝关节宽度的影响
        3.5 风湿宁对风寒湿痹证CIA小鼠模型近红外荧光活体成像的影响
    4 实验小结
    5 讨论
        5.1 阳性药物的选择
        5.2 风湿宁对模型小鼠足掌疼痛阈值的影响
        5.3 风湿宁对模型小鼠关节炎指数与踝关节宽度的影响
        5.4 风湿宁对模型小鼠近红外荧光活体成像的影响
第三部分 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织中TLR4/NF-κB信号通路的作用机制研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验药物及试剂
            1.2.1 风湿宁与来氟米特
            1.2.2 实验试剂
        1.3 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 风寒湿痹证CIA大鼠模型的建立及筛选
        2.2 风寒湿痹证CIA大鼠模型的分组及给药
        2.3 标本采集及指标检测
            2.3.1 大鼠一般情况观察
            2.3.2 大鼠血清RF、ACPA、IL-1β、IL-4、IL-10与TNF-α含量检测
            2.3.3 大鼠脾脏与胸腺指数检测
            2.3.4 大鼠膝、踝关节组织病理学观察及评分
            2.3.5 大鼠滑膜组织中细胞凋亡检测
            2.3.6 大鼠滑膜组织中c-IAP1、XIAP、Caspase-3与Caspase-9免疫组化检测
            2.3.7 大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κBmRNA表达检测
            2.3.8 大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κB蛋白表达检测
        2.4 统计学方法
    3 结果
        3.1 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型一般状态的影响
        3.2 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型关节炎指数的影响
        3.3 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型关节肿胀度的影响
        3.4 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型血清RF、ACPA含量的影响
        3.5 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型血清炎性细胞因子含量的影响
        3.6 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型血清抗炎细胞因子含量的影响
        3.7 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型脾脏与胸腺指数的影响
        3.8 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型膝、踝关节组织病理学及评分的影响
            3.8.1 各组大鼠膝关节组织病理学观察及评分结果
            3.8.2 各组大鼠踝关节组织病理学观察及评分结果
        3.9 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织细胞凋亡的影响
        3.10 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织中c-IAP1、XIAP、Caspase-3与Caspase-9免疫组化表达的影响
        3.11 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κBmRNA相对表达量的影响
        3.12 风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κB蛋白表达的影响
    4 实验小结
    5 讨论
        5.1 风湿宁的来源及方析
        5.2 风湿宁通过下调炎性细胞因子表达,上调抗炎细胞因子活性,是发挥其治疗作用的机制之一
        5.3 风湿宁通过调节免疫功能,是发挥其治疗作用的机制之一
        5.4 风湿宁可诱导滑膜细胞调亡,抑制滑膜细胞异常增殖,是发挥其治疗作用的主要机制之一
        5.5 风湿宁可抑制TLR4/NF-κB信号通路异常活化,是发挥其治疗作用的主要机制之一
第四部分 风湿宁含药血清对风寒湿痹证CIA-FLS增殖、凋亡和TLR4/NF-κB信号通路的作用机制研究
    1 实验材料
        1.1 滑膜组织来源
        1.2 制备含药血清的实验动物
        1.3 实验药物及试剂
            1.3.1 风湿宁与来氟米特
            1.3.2 实验试剂
        1.4 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 风寒湿痹证CIA模型大鼠滑膜细胞体外分离培养
            2.1.1 CIA-FLS细胞原代培养
            2.1.2 CIA-FLS细胞传代
            2.1.3 CIA-FLS细胞计数
            2.1.4 CIA-FLS细胞冻存
            2.1.5 CIA-FLS细胞复苏
        2.2 CIA-FLS细胞免疫荧光鉴定
        2.3 含药血清的制备
        2.4 CIA-FLS细胞分组及给药
        2.5 CCK-8法检测CIA-FLS细胞增殖
        2.6 TUNEL法检测CIA-FLS细胞凋亡
        2.7 ELISA法检测CIA-FLS细胞培养上清液中细胞因子含量
        2.8 Real-time PCR法检测CIA-FLS细胞中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κBmRNA表达
        2.9 Western Blot法检测CIA-FLS细胞中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κB蛋白表达
        2.10 统计学方法
    3 结果
        3.1 CIA-FLS细胞原代培养及形态学观察
        3.2 CIA-FLS细胞免疫荧光鉴定
        3.3 风湿宁含药血清对CIA-FLS细胞增殖的影响
        3.4 风湿宁含药血清对CIA-FLS细胞凋亡的影响
        3.5 风湿宁含药血清对CIA-FLS细胞培养上清液中细胞因子含量的影响
        3.6 风湿宁含药血清对CIA-FLS细胞中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κB mRNA相对表达量的影响
        3.7 风湿宁含药血清对CIA-FLS细胞中TLR4、MyD88、IκB-α与NF-κB蛋白表达的影响
    4 实验小结
    5 讨论
        5.1 CIA-FLS细胞的原代培养及鉴定
        5.2 风湿宁含药血清通过抑制CIA-FLS细胞增殖,促进其凋亡,是发挥其治疗作用的机制之一
        5.3 风湿宁含药血清通过下调CIA-FLS细胞上清液中炎性细胞因子表达,上调抗炎细胞因子活性,是发挥其治疗作用的机制之一
        5.4 风湿宁含药血清通过抑制CIA-FLS细胞中TLR4/NF-κB信号通路异常活化,是发挥其治疗作用的主要机制之一
结论
创新性与特色
问题与展望
致谢
参考文献
综述 TLRs/NF-κB信号通路与类风湿关节炎相关研究进展
    参考文献
附件1:在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果


【参考文献】:
期刊论文
[1]姜黄素对类风湿关节炎破骨细胞分化中NF-κB p65和NFATc1表达的影响[J]. 商玮,徐子涵,郭郡浩,董晓蕾,赵智明,蔡辉.  中国骨质疏松杂志. 2018(04)
[2]风湿宁对风寒湿痹证CIA大鼠模型滑膜组织中TLR4/NF-κB信号通路的影响[J]. 董小君,王永辉,侯渊,张晨曦,赵乐,周然.  中国实验方剂学杂志. 2018(10)
[3]热原诱导的Toll样受体信号传导通路研究进展[J]. 王鸣人,王灿,陈钢.  中国药师. 2018(03)
[4]NF-κB信号与类风湿关节炎患者甲氨蝶呤耐药的研究进展[J]. 姚血明,马武开,黄颖,宁乔怡,唐芳,安阳.  贵阳中医学院学报. 2017(06)
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博士论文
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[2]新痹痛灵对CIA大鼠及RSC-364细胞中HMGB1/NF-κB信号通路的影响研究[D]. 景嵘月.南京中医药大学 2015
[3]风湿宁胶囊对胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用及机制研究[D]. 马艳苗.湖北中医药大学 2013
[4]细胞凋亡抑制蛋白2在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌吉西他滨化疗的关系[D]. 张帆.福建医科大学 2009

硕士论文
[1]乌龙丹对类风湿关节炎患者NF-κB信号通路相关因子的影响[D]. 陈鑫.黑龙江中医药大学 2017
[2]壮药龙钻通痹方对RA模型大鼠IL-6、TLR4及MYD88的调节作用机制研究[D]. 陈筱悦.广西中医药大学 2017
[3]祛风清热、活血通络法对人滑膜细胞增殖和凋亡的影响[D]. 周义辉.湖北民族学院 2014



本文编号:3509479

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