CRISPR/Cas9改造酿酒酵母萜类合成通路以提高α-香树脂醇的产量

发布时间：2023-05-07 13:12

　　目的:萜类化合物(Terpenoids)为主要存在于植物的根、茎、花、叶、花、果实中的天然产物。三萜及三萜皂苷是由6个异戊二烯单元组成的萜类化合物,化学结构复杂,药理活性多样。乌索烷型三萜皂苷是由α-香树脂醇(α-amyrin)衍生而来的五环三萜类化合物。多种乌索烷型三萜,如熊果酸、18-去氢乌索酸等,具有抗菌消炎、抗血栓、保肝等生物学活性,有着较高的药物开发价值。可大多数植物所含的三萜及三萜皂苷组成成分复杂,含量不均,分离提纯提取困难,严重限制了它们的开发与利用。近年来,随着合成生物学的发展,异源生物合成使得大量获得有药用价值的天然活性成分成为了可能。因此,本论文根据合成生物学的原理,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WAT11为宿主,并结合酵母内源萜类合成通路相关关键酶基因的调控,构建高产α-amyrin的酵母菌株,为后期构建完整的三萜皂苷合成通路,并实现在酿酒酵母中持续、大量生产熊果酸、18-去氢乌索酸等乌索烷型三萜化合物奠定基础。方法:1.WAT11基因编辑靶点分析通过查阅文献,明确本实验室保存的酿酒酵母菌种WAT11的营养缺陷型。在NCBI上搜索各...

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

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英文缩略词表
摘要
Abstract
引言
第一章 文献研究
    1 植物萜类化合物的研究进展
        1.1 三萜皂苷简介
        1.2 三萜皂苷生物合成研究
        1.3 α-amyrin与其它乌索烷型萜类的研究进展
    2 合成生物学与代谢工程
        2.1 合成生物学简介
        2.2 代谢工程简介
        2.3 合成生物学与代谢工程的应用
    3 基于酿酒酵母系统的萜类合成生物学研究进展
        3.1 酵母内源MVA途径研究及改造
        3.2 在萜类药效活性成分代谢工程中的应用
    4 基因编辑技术
        4.1 ZFNs和TALENs基因组编辑技术
        4.2 CRISPR/Cas9技术
    5 课题组前期基础与研究思路
        5.1 课题组前期基础
        5.2 本课题研究思路
第二章 材料和方法
    1 材料
        1.1 菌株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 培养基配制
        1.5 酵母转化试剂
        1.6 常用软件
    2 方法
        2.1 菌株的培养
        2.2 酿酒酵母WAT11基因组分析
        2.3 CRISPR/Cas9基因插入与敲除
        2.4 酵母生长情况与代谢产物检测
        2.5 pEXPR/IaAS1质粒的转化
        2.6 IaAS1表达盒的基因敲入
        2.7 酿酒酵母香树脂醇产量检测
第三章 实验结果
    1 CRISPR/Cas9靶位点分析
        1.1 酿酒酵母WAT11基因组分析
        1.2 小结与讨论
    2 WAT11单基因编辑衍生菌株的构建与考察
        2.1 WAT11t/f/s/i1/i2/Δg菌株的构建
        2.2 WAT11t/f/s/i1/i2/Δg的生长曲线绘制
        2.3 菌株角鲨烯产量的比较
        2.4 小结与讨论
    3 WAT11多基因编辑衍生菌株的构建与考察
        3.1 WAT11tf/ti1/ts菌株的构建
        3.2 WAT11tf/ti1/ts的生长曲线绘制
        3.3 角鲨烯产量的比较
        3.4 乙酰辅酶A合酶的引入
        3.5 WAT11tfA菌株生长曲线绘制
        3.6 角鲨烯产量的比较
        3.7 小结与讨论
    4 α-amyrin的细胞工厂构建
        4.1 IaAS1基因表达盒的制备
        4.2 WAT11tfAX菌株构建与WAT11tfA游离质粒转化
        4.3 各菌株的香树脂醇产量比较
        4.4 小结与讨论
结语
    1 结论
    2 创新点
    3 展望
参考文献
附录
在校期间发表论文和参与科研情况
致谢
附件



本文编号：3810635