抑瘤素M与盐霉素联用对肝癌干细胞作用的研究

发布时间：2017-06-09 05:09

  本文关键词：抑瘤素M与盐霉素联用对肝癌干细胞作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝癌是世界上最常见的致死性肿瘤之一,每年影响超过一百万人,居世界肿瘤死亡率的第三位。肝癌对化疗、放疗不敏感,术后易复发,预后较差。因此,迫切需要新的治疗方法。肿瘤干细胞理论的出现,为肝癌的治疗开拓了新的道路。肿瘤干细胞是存在于肿瘤细胞中数量极少的一部分细胞亚群,它们具有自我更新和无限分裂的能力,比普通肿瘤细胞更加抵抗常规放化疗,与肿瘤复发和再生密切相关。因此,靶向清除肿瘤干细胞可能就是治愈肿瘤的关键。目前,诱导分化治疗是研究较多的一种靶向治疗肿瘤干细胞的疗法。抑瘤素M是一种多功能的细胞调节因子,研究发现抑瘤素M可以诱导肝癌干细胞分化,并且可以增加对传统化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性。盐霉素是一种兽用抗生素,由于其对肿瘤干细胞的抑制作用,近年来越来越受到研究者的关注。研究表明,盐霉素可以降低肝癌细胞的增殖率,促进其凋亡,同时下调CD133~+干细胞亚群的百分比。本实验以CD133为肿瘤干细胞筛选标志,通过免疫磁珠法从人肝癌细胞Hep G2细胞系中筛选出CD133~+Hep G2肝癌干细胞,拟联合抑瘤素M与盐霉素作用于CD133~+Hep G2肝癌干细胞,探讨是否可以更加显著地诱导肝癌干细胞分化。结果显示,筛选所得的CD133~+Hep G2细胞在含20ng/ml b FGF、20ng/ml EGF、2%B27的无血清DMEM/F12培养基呈悬浮生长状态,由单细胞逐渐生长为细胞微球;经含血清的培养基诱导后,细胞微球开始贴壁生长;在软琼脂固体培养基中,分选后的单细胞可以继续生长形成克隆;对分选获得的肝癌干细胞分别给予OSM、Sal和OSM+Sal处理,结果显示,OSM与Sal联合用药可以显著抑制肝癌干细胞的增殖和侵袭能力;Annexin-V-FITC双染法、JC-1法和Western Blot法检测凋亡可见联合用药组发生凋亡的细胞更多,线粒体膜电位下降的幅度更大,caspase-3的表达更多,提示联合用药诱导的凋亡作用高于单独作用组;进一步对药物作用后肝癌干细胞分化相关标志物进行检测,结果显示,肝癌干细胞表面标志物CD133的表达水平以及干性相关基因的表达水平均显著下调,肝癌标志物AFP的表达水平显著下调,肝细胞标志物ALB的表达水平显著上调,提示联合用药能够更加显著地诱导肝癌干细胞发生分化。综上所述,抑瘤素M联用盐霉素能够更加显著抑制肝癌干细胞的增殖,诱导肝癌干细胞分化,促进其凋亡。本研究为靶向治疗肝癌干细胞的研究提供了新的思路。
【关键词】：肿瘤干细胞 肝癌 诱导分化 联合用药
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文对照表12-13
• 第一章 绪论13-22
• 1.1 肝癌的简介13
• 1.2 肿瘤干细胞13-15
• 1.2.1 肿瘤干细胞的理论13
• 1.2.2 肿瘤干细胞的分离13-14
• 1.2.3 肿瘤干细胞的鉴定14-15
• 1.3 肿瘤干细胞诱导分化治疗15-17
• 1.3.1 诱导分化疗法的理论15
• 1.3.2 诱导分化剂15-16
• 1.3.3 肝癌诱导分化疗法在临床中的应用16-17
• 1.4 抑瘤素M17-19
• 1.4.1 抑瘤素M受体17-18
• 1.4.2 抑瘤素M生物学功能研究进展18-19
• 1.5 盐霉素19-20
• 1.5.1 盐霉素对肿瘤干细胞作用的研究进展19-20
• 1.5.2 盐霉素临床应用前景20
• 1.6 实验立题依据20-22
• 第二章 材料与试剂22-27
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 细胞系22
• 2.1.2 实验仪器22-23
• 2.1.3 实验主要试剂23-24
• 2.1.4 Q-PCR所用引物24
• 2.2 主要试剂配制24-27
• 2.2.1 PBS的配制24-25
• 2.2.2 DMEM高糖培养液配制25
• 2.2.3 DMEM/F12培养液的配制25
• 2.2.4 0.25%胰酶-EDTA混合液配制（10×）25
• 2.2.5 磁珠分选所用Buffer1的配制25-26
• 2.2.6 磁珠分选所用Buffer 2 的配制26
• 2.2.7 磁珠分选所用Buffer 3 的配制26
• 2.2.8 磁珠分选用DNase I的配制26
• 2.2.9 药物溶液的配制26-27
• 第三章 实验方法27-38
• 3.1 CD133~+ HepG2肝癌干细胞的分离、培养及鉴定27-30
• 3.1.1 免疫磁珠法筛选CD133~+HepG2肝癌干细胞27-28
• 3.1.2 CD133~+ HepG2肝癌干细胞的培养28-29
• 3.1.3 CD133~+ HepG2肝癌干细胞的鉴定29-30
• 3.2 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞增殖的影响30-31
• 3.3 联合用药对CD133~+HepG2肝癌干细胞凋亡的影响31-32
• 3.3.1 Annexin V -FITC-PI双染法检测细胞凋亡31
• 3.3.2 细胞凋亡线粒体膜电位检测（JC-1）31
• 3.3.3 Western Blot检测caspase3蛋白的表达31-32
• 3.4 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞侵袭能力的影响32-33
• 3.5 联合用药诱导CD133~+ HepG2肝癌干细胞分化相关标志物的检测33-37
• 3.5.1 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞中CD133表达水平的影响33
• 3.5.2 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞中干性相关基因表达水平的影响33-35
• 3.5.3 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞AFP、ALB表达水平的影响35-37
• 3.6 统计学分析37-38
• 第四章 实验结果38-50
• 4.1 CD133~+ HepG2肝癌干细胞的分离、培养及鉴定38-40
• 4.1.1 CD133~+ HepG2肝癌干细胞的筛选38
• 4.1.2 CD133~+HepG2肝癌干细胞的培养38-39
• 4.1.3 CD133~+ HepG2肝癌干细胞的鉴定39-40
• 4.2 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞增殖的影响40-42
• 4.3 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞凋亡的影响42-45
• 4.3.1 Annexin V -FITC/PI双染法检测细胞凋亡42-43
• 4.3.2 细胞凋亡线粒体膜电位检测（JC-1）43-44
• 4.3.3 Western Blot检测cleaved caspase3蛋白的表达44-45
• 4.4 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞侵袭能力的影响45-46
• 4.5 联合用药诱导CD133~+HepG2肝癌干细胞分化相关标志物的检测46-50
• 4.5.1 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞中CD133表达水平的影响46-47
• 4.5.2 联合用药对CD133~+HepG2肝癌干细胞中干性相关基因表达水平的影响47-48
• 4.5.3 联合用药对CD133~+ HepG2肝癌干细胞AFP、ALB表达水平的影响48-50
• 第五章 讨论50-52
• 第六章 结论52-53
• 参考文献53-57
• 致谢57

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  本文关键词：抑瘤素M与盐霉素联用对肝癌干细胞作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：434504